| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 缩略语表（Abbreviation） | 第13-15页 |
| 第1章 文献综述 | 第15-40页 |
| 1.1 伪狂犬病毒简介 | 第15页 |
| 1.2 伪狂犬病病原学特征 | 第15-16页 |
| 1.3 伪狂犬病毒的分子生物学特性 | 第16-25页 |
| 1.3.1 基因组结构 | 第16-18页 |
| 1.3.2 基因的功能 | 第18-25页 |
| 1.3.2.1 必需糖蛋白 | 第19-21页 |
| 1.3.2.2 非必需糖蛋白 | 第21-22页 |
| 1.3.2.3 其他蛋白 | 第22-25页 |
| 1.4 致病机制 | 第25-29页 |
| 1.4.1 病毒的侵入与复制过程 | 第25-27页 |
| 1.4.2 病毒在细胞间的传播 | 第27-28页 |
| 1.4.3 潜伏感染 | 第28-29页 |
| 1.5 伪狂犬病毒的疫苗研究 | 第29页 |
| 1.6 疱疹病毒miRNA研究进展 | 第29-40页 |
| 1.6.1 miRNA的生物合成过程 | 第29-32页 |
| 1.6.2 MiRNA的作用机制 | 第32-33页 |
| 1.6.3 疱疹病毒miRNA | 第33-36页 |
| 1.6.4 病毒miRNA的功能 | 第36-40页 |
| 第2章 PRV Ea株全基因组测序 | 第40-61页 |
| 2.1 前言 | 第40-41页 |
| 2.2 试验材料 | 第41-45页 |
| 2.3 试验方法 | 第45-50页 |
| 2.3.1 PRV不同毒株的生物学特性比较 | 第45-46页 |
| 2.3.2 PRV Ea株全基因组测序 | 第46-47页 |
| 2.3.3 基因注释 | 第47页 |
| 2.3.4 序列比对及进化树分析 | 第47-48页 |
| 2.3.5 限制性片段长度多态性分析（RFLP） | 第48页 |
| 2.3.6 病毒粒子提取 | 第48页 |
| 2.3.7 考马斯亮蓝染色 | 第48-49页 |
| 2.3.8 Western Blot | 第49页 |
| 2.3.9 间接免疫荧光（IFA） | 第49页 |
| 2.3.10 统计学方法 | 第49-50页 |
| 2.4 结果与分析 | 第50-58页 |
| 2.4.1 伪狂犬病毒不同毒株空斑大小比较 | 第50-51页 |
| 2.4.2 一步法增殖曲线 | 第51页 |
| 2.4.3 PRV Ea株全基因组测序 | 第51-52页 |
| 2.4.4 进化树分析 | 第52-53页 |
| 2.4.5 限制性片段长度多态性分析（RFLP） | 第53-54页 |
| 2.4.6 编码基因氨基酸序列比对分析 | 第54-55页 |
| 2.4.7 病毒粒子结构蛋白比较分析 | 第55-57页 |
| 2.4.8 感染细胞病毒蛋白比较分析 | 第57-58页 |
| 2.5 讨论 | 第58-59页 |
| 2.6 小结 | 第59-61页 |
| 第3章 LLT miRNA簇对PRV毒力的影响 | 第61-89页 |
| 3.1 前言 | 第61-62页 |
| 3.2 试验材料 | 第62-67页 |
| 3.2.1 病毒、细胞、菌种与抗体 | 第62-63页 |
| 3.2.2 载体与质粒 | 第63页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第63-64页 |
| 3.2.4 主要缓冲液与相关试剂及其配制 | 第64-66页 |
| 3.2.4.1 细胞培养液及其配制 | 第64页 |
| 3.2.4.2 大肠杆菌培养基及其配制 | 第64页 |
| 3.2.4.3 碱裂解法质粒提取溶液及其配制 | 第64-65页 |
| 3.2.4.4 Northern Blot缓冲液及试剂 | 第65-66页 |
| 3.2.4.5 其他缓冲液及试剂 | 第66页 |
| 3.2.5 主要实验仪器及设备 | 第66页 |
| 3.2.6 本研究中所用的寡核苷酸引物 | 第66-67页 |
| 3.2.7 实验动物 | 第67页 |
| 3.2.8 分子生物学信息软件 | 第67页 |
| 3.3 试验方法 | 第67-79页 |
| 3.3.1 LLT miRNA簇真核表达质粒的构建 | 第67-69页 |
| 3.3.2 PRV阴性对照质粒的构建 | 第69页 |
| 3.3.3 质粒大量提取 | 第69-70页 |
| 3.3.4 质粒转染（脂质体介导转染法） | 第70-71页 |
| 3.3.5 细胞总RNA提取 | 第71页 |
| 3.3.6 RNA的质量鉴定 | 第71页 |
| 3.3.7 茎环PCR检测miRNA | 第71-73页 |
| 3.3.8 Poly(A)加尾法miRNA检测 | 第73-75页 |
| 3.3.9 Northern Blot检测 | 第75-77页 |
| 3.3.10 动物实验 | 第77-78页 |
| 3.3.10.1 小鼠实验 | 第77页 |
| 3.3.10.2 猪动物实验 | 第77-78页 |
| 3.3.11 统计学方法 | 第78-79页 |
| 3.4 结果与分析 | 第79-86页 |
| 3.4.1 LLT miRNA簇真核表达质粒的构建 | 第79-80页 |
| 3.4.2 PRV阴性对照质粒的构建 | 第80页 |
| 3.4.3 LLT miRNA簇缺失株不能表达病毒miRNA | 第80-81页 |
| 3.4.4 LLT miRNA簇缺失对PRV毒力的影响 | 第81-84页 |
| 3.4.4.1 仔猪攻毒试验 | 第81-82页 |
| 3.4.4.2 鼻眼拭子分毒试验 | 第82-83页 |
| 3.4.4.3 基因组拷贝数分析 | 第83页 |
| 3.4.4.4 血清中和试验 | 第83-84页 |
| 3.4.5 LLT miRNA簇的体外表达 | 第84-85页 |
| 3.4.6 LLT miRNA簇提高小鼠的抗病毒能力 | 第85-86页 |
| 3.5 讨论 | 第86-88页 |
| 3.6 小结 | 第88-89页 |
| 第4章 PRV Ea株细菌人工染色体克隆及miRNA7突变株的构建 | 第89-105页 |
| 4.1 前言 | 第89页 |
| 4.2 试验材料 | 第89-91页 |
| 4.2.1 病毒、细胞、菌种与抗体 | 第89页 |
| 4.2.2 载体与质粒 | 第89-90页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第90页 |
| 4.2.4 细胞培养液及其配制 | 第90页 |
| 4.2.5 细菌培养基及其配制 | 第90页 |
| 4.2.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制 | 第90-91页 |
| 4.2.7 主要实验仪器及设备 | 第91页 |
| 4.2.8 分子生物学信息软件 | 第91页 |
| 4.2.9 本研究中所用的寡核苷酸引物 | 第91页 |
| 4.3 试验方法 | 第91-97页 |
| 4.3.1 上下游同源臂克隆及中间转移载体构建 | 第91-92页 |
| 4.3.2 同源重组 | 第92页 |
| 4.3.3 重组病毒空斑纯化 | 第92页 |
| 4.3.4 病毒基因组的小量制备 | 第92-93页 |
| 4.3.5 重组病毒的PCR鉴定 | 第93页 |
| 4.3.6 大肠杆菌电转感受态细胞的制备 | 第93页 |
| 4.3.7 重组病毒环状基因组提取 | 第93-94页 |
| 4.3.8 重组病毒环状基因组电转化 | 第94页 |
| 4.3.9 pPRV-BAC验证 | 第94页 |
| 4.3.10 重组病毒的拯救 | 第94-95页 |
| 4.3.11 BAC骨架的去除 | 第95页 |
| 4.3.12 利用Red重组技术构建PRV miRNA7缺失突变株 | 第95-96页 |
| 4.3.12.1 Kan表达核DNA片段的PCR扩增 | 第95-96页 |
| 4.3.12.2 第一步Red重组 | 第96页 |
| 4.3.12.3 第二步Red重组 | 第96页 |
| 4.3.12.4 pPRV-ΔmiR7突变株的拯救 | 第96页 |
| 4.3.13 利用Red重组技术构建PRV miRNA7回复突变株 | 第96-97页 |
| 4.3.14 重组病毒体外生长特性 | 第97页 |
| 4.4 结果与分析 | 第97-103页 |
| 4.4.1 上下游同源臂克隆及中间转移载体构建 | 第97页 |
| 4.4.2 重组病毒的构建与筛选纯化 | 第97-98页 |
| 4.4.3 pPRV-BAC克隆筛选 | 第98-99页 |
| 4.4.4 重组病毒的拯救 | 第99-100页 |
| 4.4.5 PRV miRNA7缺失突变株的构建 | 第100-101页 |
| 4.4.6 PRV miRNA7缺失突变株中BAC骨架的去除 | 第101页 |
| 4.4.7 PRV miRNA7回复突变株的构建 | 第101-102页 |
| 4.4.8 重组病毒体外生长特性 | 第102-103页 |
| 4.5 讨论 | 第103-104页 |
| 4.6 小结 | 第104-105页 |
| 第5章 结论 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-117页 |
| 附录1 | 第117-125页 |
| 附录2 | 第125-126页 |
| 致谢 | 第126-127页 |
