| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7页 |
| 1. 前言 | 第8-12页 |
| 2. 实验材料与试剂 | 第12-18页 |
| 2.1 实验材料 | 第12页 |
| 2.2 主要试剂、酶类 | 第12-14页 |
| 2.3 菌株和质粒 | 第14页 |
| 2.4 主要试剂配制 | 第14-15页 |
| 2.5 主要仪器设备 | 第15-17页 |
| 2.6 计算机软件及数据库 | 第17-18页 |
| 3. 实验方法 | 第18-29页 |
| 3.1 TPNPPASE的随机突变和定向进化 | 第18-21页 |
| 3.1.1 随机突变易错PCR | 第18-19页 |
| 3.1.2 随机突变文库的构建与热稳定性突变体的筛选 | 第19-20页 |
| 3.1.3 PQE_30表达载体去磷酸化 | 第20页 |
| 3.1.4 PCR产物片段与PQE_30载体的连接 | 第20-21页 |
| 3.1.5 大肠杆菌M15感受态细胞制备(CACL_2法) | 第21页 |
| 3.1.6 融合蛋白的转化 | 第21页 |
| 3.2 热稳定性升高突变体筛选 | 第21-22页 |
| 3.2.1 热处理温度的确定 | 第21-22页 |
| 3.2.2 热稳定性升高突变体的筛选 | 第22页 |
| 3.3 突变体融合蛋白的表达纯化 | 第22-24页 |
| 3.3.1 突变体蛋白的表达 | 第22页 |
| 3.3.2 突变体蛋白的纯化 | 第22-23页 |
| 3.3.3 SDS-PAGE胶配制方法 | 第23页 |
| 3.3.4 超滤操作方法 | 第23-24页 |
| 3.3.5 蛋白浓度测定方法 | 第24页 |
| 3.4 酶学性质测定 | 第24-26页 |
| 3.4.1 T_(1/2)值测定 | 第24-25页 |
| 3.4.2 热稳定性测定 | 第25页 |
| 3.4.3 酶活力(KM、VMAX)测定 | 第25页 |
| 3.4.4 TM值测定 | 第25-26页 |
| 3.5 结晶蛋白的表达纯化 | 第26页 |
| 3.6 结晶条件筛选与优化 | 第26-27页 |
| 3.6.1 TPNPPASE突变体蛋白结晶条件的筛选 | 第26页 |
| 3.6.2 TPNPPASE突变体蛋白结晶条件的优化 | 第26-27页 |
| 3.7 X-射线衍射数据的收集 | 第27页 |
| 3.7.1 防冻剂筛选 | 第27页 |
| 3.7.2 X-射线衍射数据的收集 | 第27页 |
| 3.8 蛋白结构解析 | 第27-29页 |
| 4. 结果与讨论 | 第29-57页 |
| 4.1 热稳定性增强的TPNPPASE突变体的筛选与鉴定 | 第29-30页 |
| 4.2 突变体蛋白的表达纯化 | 第30-32页 |
| 4.2.1 突变体蛋白的原核表达 | 第30-31页 |
| 4.2.2 突变体蛋白的纯化 | 第31-32页 |
| 4.3 突变体蛋白酶学性质的测定 | 第32-38页 |
| 4.3.1 蛋白质酶活的测定 | 第32-34页 |
| 4.3.2 蛋白质T_(1/2)值测定 | 第34-35页 |
| 4.3.3 蛋白质T_M值测定 | 第35-37页 |
| 4.3.4 蛋白质热稳定性测定 | 第37-38页 |
| 4.4 H170Y、Q173G突变体TPNPPASE的结构解析 | 第38-57页 |
| 4.4.1 结晶条件的筛选 | 第38-39页 |
| 4.4.2 防冻剂筛选 | 第39-41页 |
| 4.4.3 衍射数据收集 | 第41-42页 |
| 4.4.4 晶体结构解析 | 第42-44页 |
| 4.4.5 晶体结构模型质量分析 | 第44-47页 |
| 4.4.6 晶体结构分析 | 第47-57页 |
| 5. 小结与展望 | 第57-58页 |
| 6. 综述 | 第58-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 硕士期间参与的文章发表 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-77页 |
