| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 研究背景及意义 | 第10-31页 |
| 1.1 研究背景 | 第10-30页 |
| 1.1.1 植物中的sRNA | 第11-16页 |
| 1.1.1.1 植物中的miRNA | 第12-13页 |
| 1.1.1.2 植物中的nat-siRNA | 第13页 |
| 1.1.1.3 植物中的secondary siRNA：phased siRNA和trans-acting siRNA | 第13-16页 |
| 1.1.1.4 DNA双链断裂诱导产生的RNA | 第16页 |
| 1.1.2 植物miRNA产生过程中的调控 | 第16-23页 |
| 1.1.2.1 MIR基因的转录调控 | 第17-19页 |
| 1.1.2.2 DCL1活性的调控 | 第19-21页 |
| 1.1.2.3 DCL1和HYL1的调控 | 第21-22页 |
| 1.1.2.4 剪切对pri-miRNA切割的影响 | 第22-23页 |
| 1.1.3 miRNA的稳定性和降解：甲基化,尿苷化和核酸外切酶 | 第23-25页 |
| 1.1.4 miRNA活性的调控 | 第25-30页 |
| 1.1.4.1 AGO蛋白 | 第25-27页 |
| 1.1.4.2 AGO1与miRNA的结合 | 第27页 |
| 1.1.4.3 miRNA介导的靶标切割 | 第27-28页 |
| 1.1.4.4 miRNA介导的翻译抑制 | 第28-30页 |
| 1.1.4.5 miRNA介导的DNA甲基化 | 第30页 |
| 1.2 展望 | 第30-31页 |
| 第二章 实验材料与实验方法 | 第31-55页 |
| 2.1 实验材料和试剂 | 第31-32页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第31页 |
| 2.1.2 植物培养 | 第31页 |
| 2.1.3 载体构建 | 第31页 |
| 2.1.4 基因组DNA提取 | 第31页 |
| 2.1.5 全基因组重测序 | 第31-32页 |
| 2.1.6 RNA提取、反转录与荧光定量PCR | 第32页 |
| 2.1.7 sRNA northern和克隆 | 第32页 |
| 2.1.8 免疫沉淀和western检测 | 第32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-55页 |
| 2.2.1 植物培养 | 第32-33页 |
| 2.2.1.1 培养土中拟南芥的培养 | 第32-33页 |
| 2.2.1.2 拟南芥在1/2 MS培养基上培养 | 第33页 |
| 2.2.2 突变体的筛选 | 第33-34页 |
| 2.2.2.1 amiR-triOX转基因系的构建 | 第33页 |
| 2.2.2.2 EMS诱变及筛选 | 第33-34页 |
| 2.2.3 基因组DNA的提取 | 第34页 |
| 2.2.4 基于全基因组重测序的方法克隆突变体基因 | 第34-36页 |
| 2.2.4.1 克隆群体的建立 | 第34页 |
| 2.2.4.2 全基因组重测序文库的建立 | 第34-36页 |
| 2.2.4.3 测序数据的分析及验证 | 第36页 |
| 2.2.5 Real time PCR检测miRNA靶基因的表达 | 第36-39页 |
| 2.2.5.1 植物总RNA的提取 | 第36页 |
| 2.2.5.2 DNA酶消化总RNA中的DNA | 第36-37页 |
| 2.2.5.3 RNA反转录合成cDNA的第一链 | 第37-38页 |
| 2.2.5.4 Real time PCR | 第38-39页 |
| 2.2.6 Northern blot检测miRNA的表达 | 第39-41页 |
| 2.2.6.1 植物小RNA的提取 | 第39页 |
| 2.2.6.2 小RNA的垂直板电泳 | 第39-40页 |
| 2.2.6.3 转膜 | 第40页 |
| 2.2.6.4 探针标记和杂交 | 第40-41页 |
| 2.2.6.5 洗膜和显影 | 第41页 |
| 2.2.7 载体构建 | 第41-45页 |
| 2.2.7.1 PCR扩增目标片段 | 第41-42页 |
| 2.2.7.2 PCR产物的琼脂糖凝胶纯化 | 第42页 |
| 2.2.7.3 酶切 | 第42页 |
| 2.2.7.4 连接 | 第42-43页 |
| 2.2.7.5 大肠杆菌热激转化 | 第43页 |
| 2.2.7.6 碱裂解法小量提取大肠杆菌质粒 | 第43-44页 |
| 2.2.7.7 TOPO克隆构建入门载体 | 第44页 |
| 2.2.7.8 LR重组反应 | 第44-45页 |
| 2.2.8 原生质体瞬时表达和蛋白免疫共沉淀 | 第45-47页 |
| 2.2.8.1 质粒大提 | 第45页 |
| 2.2.8.2 氯化铯(CsCl)密度梯度离心分离质粒和纯化 | 第45-46页 |
| 2.2.8.3 原生质体制备和转化 | 第46页 |
| 2.2.8.4 原生质体蛋白提取和蛋白Co-IP | 第46-47页 |
| 2.2.9 拟南芥GUS染色 | 第47-48页 |
| 2.2.10 酵母双杂交验证蛋白相互作用 | 第48-49页 |
| 2.2.10.1 载体的构建 | 第48页 |
| 2.2.10.2 酵母感受态的制作 | 第48页 |
| 2.2.10.3 酵母的转化 | 第48页 |
| 2.2.10.4 相互作用的观察 | 第48-49页 |
| 2.2.11 双分子荧光互补验证蛋白相互作用 | 第49页 |
| 2.2.11.1 载体构建及农杆菌转化 | 第49页 |
| 2.2.11.2 烟草瞬时表达 | 第49页 |
| 2.2.12 农杆菌介导的拟南芥转基因 | 第49-50页 |
| 2.2.13 Western Blot检测蛋白表达 | 第50-51页 |
| 2.2.14 SOE4原核蛋白表达和纯化 | 第51页 |
| 2.2.15 RNA体外转录 | 第51-53页 |
| 2.2.15.1 DNA模板的PCR以及回收 | 第51-52页 |
| 2.2.15.2 体外转录以及变性PAGE纯化转录产物 | 第52-53页 |
| 2.2.16 凝胶迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA) | 第53-55页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第55-72页 |
| 3.1 实验结果 | 第55-71页 |
| 3.1.1 soe4突变体的分离和鉴定 | 第55-62页 |
| 3.1.1.1 amiR-triOX转c系的建立及突变体的筛选 | 第55-56页 |
| 3.1.1.2 ema1抑制子(suppressor of ema1,soe)的遗传筛选 | 第56-59页 |
| 3.1.1.4 soe4突变体的分离和鉴定 | 第59-62页 |
| 3.1.2 SOE4基因的初步研究 | 第62-63页 |
| 3.1.3 SOE4在miRNA通路中的功能 | 第63-71页 |
| 3.1.3.0 SOE4正调节miRNA的积累 | 第63-64页 |
| 3.1.3.1 SOE4蛋白定位在D-body中 | 第64-66页 |
| 3.1.3.2 SOE4蛋白与DCL1,HYL1和SE相互作用 | 第66-68页 |
| 3.1.3.3 SOE4蛋白的不同结构域的功能研究 | 第68页 |
| 3.1.3.4 SOE4蛋白与RNA的结合 | 第68-70页 |
| 3.1.3.5 soe4突变影响pri-miRNA的积累 | 第70-71页 |
| 3.2 讨论 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-84页 |
| 附录 | 第84-92页 |
| 附录一：缩略词对照表 | 第84-89页 |
| 附录二：本研究所用到的引物序列 | 第89-92页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
