| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 中英文缩略词表 | 第11-12页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 第一篇 文献综述 | 第13-31页 |
| 第一章 猪流行性腹泻(PED) | 第13-19页 |
| 1 流行病学 | 第13-16页 |
| 2 临床及剖检症状 | 第16页 |
| 3 诊断和防制 | 第16-19页 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒(PEDV) | 第19-25页 |
| 1 冠状病毒概述 | 第19-21页 |
| 2 PEDV分子结构及遗传特征 | 第21-23页 |
| 2.1 PEDV分子结构 | 第21-22页 |
| 2.2 PEDV的基因组结构 | 第22-23页 |
| 3 PEDV的理化、生物学特性 | 第23-24页 |
| 4 PEDV的细胞培养特性 | 第24-25页 |
| 第三章 S蛋白与PEDV细胞适应性关系研究进展 | 第25-31页 |
| 1 PEDVS蛋白与细胞适应性 | 第25-28页 |
| 2 基于RNA重组技术的反向遗传学操作系统研究进展 | 第28-29页 |
| 3 本研究的目的及意义 | 第29-31页 |
| 第二篇 实验研究 | 第31-63页 |
| 第四章 现有转移载体对应毒株的拯救 | 第31-49页 |
| 1 实验材料 | 第32-34页 |
| 1.1 细胞和菌种 | 第32页 |
| 1.2 质粒 | 第32页 |
| 1.3 酶及主要试剂、试剂盒 | 第32-33页 |
| 1.4 主要仪器 | 第33-34页 |
| 1.5 分析软件 | 第34页 |
| 2 实验方法 | 第34-43页 |
| 2.1 VERO、LR7细胞的复苏、传代、冻存 | 第34-36页 |
| 2.2 VERO细胞胰酶适应浓度验证 | 第36页 |
| 2.3 mPEDV病毒的增殖、收毒以及滴度测定 | 第36-37页 |
| 2.4 感受态的制备 | 第37页 |
| 2.5 转移载体的克隆和扩增 | 第37-38页 |
| 2.6 质粒提取、酶切鉴定、浓度测定 | 第38页 |
| 2.7 质粒线性化、纯化、浓度测定 | 第38-39页 |
| 2.8 体外转录RNA、RNA电泳鉴定 | 第39页 |
| 2.9 RNA电击转染 | 第39-40页 |
| 2.10 重组病毒传代 | 第40页 |
| 2.11 RLUC值测定 | 第40页 |
| 2.12 重组病毒RNA提取、RT-PCR | 第40-42页 |
| 2.13 重组病毒基因序列分析 | 第42页 |
| 2.14 核酸电泳 | 第42页 |
| 2.15 常用试剂的配制 | 第42-43页 |
| 3 实验结果 | 第43-47页 |
| 3.1 VERO细胞胰酶适应浓度 | 第43页 |
| 3.2 mPEDV滴度 | 第43页 |
| 3.3 转移载体酶切鉴定结果及浓度 | 第43页 |
| 3.4 转移载体线性化纯化浓度 | 第43-44页 |
| 3.5 体外转录RNA电泳鉴定 | 第44页 |
| 3.6 重组病毒传代观察结果 | 第44-45页 |
| 3.7 RLUC值 | 第45-46页 |
| 3.8 重组病毒RNA RT-PCR结果 | 第46页 |
| 3.9 重组病毒S基因和RLUC基因序列分析结果 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| 第五章 基于S基因功能域的转移载体的构建 | 第49-63页 |
| 1 实验材料 | 第50页 |
| 1.1 质粒和载体 | 第50页 |
| 1.2 酶及主要试剂 | 第50页 |
| 1.3 引物 | 第50页 |
| 2 实验方法 | 第50-60页 |
| 2.1 非细胞适应毒株S基因质粒扩增、酶切鉴定、序列分析 | 第51页 |
| 2.2 细胞适应株和非细胞适应株酶切位点分析 | 第51页 |
| 2.3 引物的设计、合成和处理 | 第51-52页 |
| 2.4 PCR扩增目的片段及胶回收 | 第52-55页 |
| 2.5 小片段的融合PCR及胶回收 | 第55-56页 |
| 2.6 融合片段的克隆至载体并鉴定 | 第56-58页 |
| 2.7 酶切融合片段连pJET-Blunt载体质粒和pPEDV质粒及胶回收 | 第58页 |
| 2.8 连接融合片段和载体片段并转化 | 第58-59页 |
| 2.9 转移载体提取、酶切、浓度测定 | 第59-60页 |
| 3 实验结果 | 第60-62页 |
| 3.1 非细胞适应毒株S基因质粒扩增 | 第60页 |
| 3.2 细胞适应株和非细胞适应株酶切位点 | 第60页 |
| 3.3 PCR扩增目的片段 | 第60页 |
| 3.4 融合片段电泳鉴定 | 第60-61页 |
| 3.5 融合片段质粒鉴定 | 第61页 |
| 3.6 转移载体酶切结果 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-63页 |
| 全文结论 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
