| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 引言 | 第9-24页 |
| 一、油菜菌核病 | 第9-15页 |
| (一) 病害症状与危害 | 第9-10页 |
| 1、症状 | 第9-10页 |
| 2、发生与危害 | 第10页 |
| (二) 病菌及其致病机理 | 第10-13页 |
| 1、病菌 | 第10-11页 |
| 2、致病机理 | 第11-13页 |
| (三) 油菜抗病及其机制 | 第13-15页 |
| 1、避病 | 第13页 |
| 2、形态结构抗性 | 第13页 |
| 3、酶活性变化 | 第13-14页 |
| 4、对草酸耐性 | 第14页 |
| 5、抗病组织病理学及生理生化 | 第14-15页 |
| (四) 病害防治 | 第15页 |
| 二、植物抗病分子机制 | 第15-19页 |
| (一) 植物抗病类型 | 第16页 |
| 1 与病原物亲和性互作抗病性 | 第16页 |
| 2 与病原物非亲和性互作抗病性 | 第16页 |
| (二) 植物抗病基因 | 第16-18页 |
| (三) 植物防卫基因 | 第18-19页 |
| (四) 植物抗病信号传导 | 第19页 |
| 三、植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因及抗病功能 | 第19-23页 |
| (一) pgip基因及其表达 | 第20页 |
| (二) PGIP理化特性及其结构 | 第20-21页 |
| (三) PGIP含量与分布 | 第21页 |
| (四) PGIP抗病功能及其机制 | 第21-22页 |
| (五) PGIP在植物抗病基因工程中的应用 | 第22-23页 |
| 四、油菜PGIP及其基因研究 | 第23页 |
| 五、本研究目的与意义 | 第23-24页 |
| 材料与方法 | 第24-41页 |
| 一、供试植株 | 第24页 |
| 二、供试菌株 | 第24页 |
| (一) 油菜菌核病菌 | 第24页 |
| (二) 大肠杆菌 | 第24页 |
| 三、质粒载体 | 第24页 |
| 四、试剂和仪器 | 第24-26页 |
| (一) 主要试剂 | 第24-25页 |
| (二) 培养基 | 第25页 |
| 1、Luria-Bertani培养基(LB) | 第25页 |
| 2、改良的Marcus培养基 | 第25页 |
| (三) 主要仪器 | 第25-26页 |
| 五、常用溶液 | 第26-28页 |
| (一) 提取基因组DNA所需溶液 | 第26页 |
| (二) 核酸电泳缓冲液 | 第26页 |
| (三) 提取质粒DNA的碱裂解缓冲液 | 第26-27页 |
| (四) 制备大肠杆菌感受态细胞溶液 | 第27页 |
| (五) 抗生素 | 第27页 |
| (六) 诱导蛋白表达溶液 | 第27页 |
| (七) 蛋白样品制备缓冲液 | 第27页 |
| (八) SDS-PAGE所需溶液 | 第27-28页 |
| 六、油菜基因组DNA提取 | 第28页 |
| (一) DNA提取(CTAB法) | 第28页 |
| (二) DNA浓度与纯度的测定 | 第28页 |
| 七、油菜Bnpgip2-1基因克隆 | 第28-31页 |
| (一) 引物设计 | 第28-29页 |
| (二) PCR扩增 | 第29页 |
| (三) PCR产物回收 | 第29页 |
| (四) 重组质粒构建 | 第29-30页 |
| (五) 感受态细胞制备与转化 | 第30页 |
| 1、感受态细胞制备 | 第30页 |
| 2、转化 | 第30页 |
| (六) 重组质粒的提取与PCR验证 | 第30-31页 |
| 1、重组质粒提取(碱裂解法) | 第30-31页 |
| 2、PCR验证 | 第31页 |
| (七) 测序 | 第31页 |
| 八、油菜Bnpgip2-1基因的生物信息学分析 | 第31-32页 |
| (一) 序列相似性比对 | 第31页 |
| (二) ORF查找 | 第31页 |
| (三) 蛋白质结构预测 | 第31-32页 |
| (四) 蛋白质性质与功能分析 | 第32页 |
| 九、油菜Bnpgip2-1基因的原核表达 | 第32-36页 |
| (一) 表达载体的构建 | 第32-33页 |
| 1 引物设计 | 第32页 |
| 2、PCR扩增 | 第32-33页 |
| 3、双酶切 | 第33页 |
| 4、连接 | 第33页 |
| (二) 重组质粒转化 | 第33-34页 |
| (三) PCR验证 | 第34页 |
| (四) 表达产物SDS-PAGE检测 | 第34-36页 |
| 1、诱导条件筛选 | 第34页 |
| 2、细胞全蛋白样品的制备 | 第34-35页 |
| 3、SDS-PAGE分析 | 第35-36页 |
| 十、BnPGIP2-1对油菜菌核病菌PG抑制的测定 | 第36-38页 |
| (一) BnPGIP2-1粗蛋白的提取 | 第36-37页 |
| 1、可溶性蛋白 | 第36页 |
| 2、包涵体型蛋白 | 第36-37页 |
| (二) 病菌PG酶的提取 | 第37页 |
| (三) BnPGIP2-1蛋白对病菌PG酶抑制的测定 | 第37-38页 |
| 十一、油菜Bnpgip2-1基因的诱导表达 | 第38-41页 |
| (一) 病菌接种 | 第38-39页 |
| (二) SA、JA处理 | 第39页 |
| (三) 总RNA提取 | 第39页 |
| (四) RT-PCR | 第39-41页 |
| 结果与分析 | 第41-52页 |
| 一、油菜Bnpgip2-1基因的克隆与生物信息学分析 | 第41-48页 |
| (一) 油菜基因组DNA提取 | 第41-42页 |
| 1、基因组DNA提取 | 第41-42页 |
| 2、DNA浓度及纯度测定 | 第42页 |
| (二) Bnpgip2-1基因克隆 | 第42-43页 |
| (三) Bnpgip2-1生物信息学分析 | 第43-48页 |
| 1、ORF与序列相似性 | 第43-44页 |
| 2、蛋白质一级结构 | 第44-45页 |
| 3、蛋白质二级结构 | 第45页 |
| 4、蛋白质性质与功能 | 第45-48页 |
| 二、油菜Bnpgp2-1基因的原核表达 | 第48-50页 |
| (一) 表达载体的构建 | 第48-50页 |
| (二) 重组质粒转化 | 第50页 |
| (三) PCR验证 | 第50页 |
| (四) Bnpgip2-1基因的原核表达 | 第50页 |
| 三、BnPGIP2-1对油菜菌核病菌PG抑制测定 | 第50-51页 |
| 四、油菜Bnpgip2-1基因的诱导表达 | 第51-52页 |
| 讨论 | 第52-56页 |
| 一、油菜Bnpgip2-1基因及其产物的特征 | 第52页 |
| 二、油菜Bnpgip2-1基因的表达 | 第52-53页 |
| 三、油菜Bnpgip2-1基因的功能 | 第53-54页 |
| 四、Bnpgip2-1基因在油菜抗病育种中的利用 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-64页 |
| 附录一 | 第64-65页 |
| 附录二 表达载体pET-28a((+)质粒图谱 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
