| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 第一部分 研究背景 | 第13-27页 |
| ·人BMPR2基因及编码蛋白分子生物学 | 第13-14页 |
| ·BMPR-Ⅱ所在的信号转导通路 | 第14-16页 |
| ·BMPR2基因突变与肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH) | 第16-21页 |
| ·BMPR2基因的表达与肿瘤 | 第21-23页 |
| ·BMPs及BMPRs与骨的形成与再生 | 第23页 |
| ·BMPR-Ⅱ与胚胎发育和器官形成 | 第23-25页 |
| ·BMPR2基因表达调控的研究现状及本课题的意义 | 第25-27页 |
| 第二部分 人BMPR2基因转录起始位点的确定及5′前导序列的生物信息学分析 | 第27-57页 |
| ·材料 | 第27-29页 |
| ·主要仪器和设备 | 第27页 |
| ·质粒、菌株、细胞株 | 第27页 |
| ·主要试剂 | 第27-28页 |
| ·培养基及溶液配方 | 第28-29页 |
| ·方法 | 第29-37页 |
| ·A549细胞的培养及收集 | 第29页 |
| ·总RNA的提取 | 第29-30页 |
| ·RNA完整性的鉴定 | 第30页 |
| ·RNA的纯度及含量测定 | 第30页 |
| ·人BMPR2基因转录起始位点的预测 | 第30-32页 |
| ·RT-PCR对人BMPR2基因mRNA 5′端的步移 | 第32-34页 |
| ·5′ RACE精确定位人BMPR2基因的转录起始位点 | 第34-36页 |
| ·RT-PCR验证RACE结果 | 第36-37页 |
| ·人BMPR2基因5′-前导序列的生物信息学分析 | 第37页 |
| ·结果 | 第37-49页 |
| ·RNA的鉴定 | 第37页 |
| ·人BMPR2基因转录起始位点预测 | 第37-38页 |
| ·RT-PCR对人BMPR2基因cDNA5′端的步移 | 第38-39页 |
| ·5′ RACE对人BMPR2基因转录起始位点的精确定位 | 第39-42页 |
| ·RT-PCR验证RACE结果 | 第42-44页 |
| ·5′前导序列的生物信息学分析 | 第44-49页 |
| ·讨论 | 第49-56页 |
| ·确定转录起始位点方法的选择 | 第49-50页 |
| ·关于转录起始位点的预测 | 第50-51页 |
| ·关于5′ RACE | 第51-53页 |
| ·人BMPR2基因5′前导序列的结构 | 第53-56页 |
| ·本部分小结 | 第56-57页 |
| 第三部分 人BMPR2基因5′侧翼序列的转录调控功能 | 第57-91页 |
| ·材料 | 第58-60页 |
| ·菌种、载体和细胞系 | 第58-59页 |
| ·主要试剂 | 第59页 |
| ·主要仪器 | 第59-60页 |
| ·方法 | 第60-74页 |
| ·人BMPR2基因5′侧翼大片段的克隆 | 第60-67页 |
| ·人BMPR2基因5′侧翼缺失体片段报告载体的构建 | 第67-70页 |
| ·细胞培养、转染及瞬时表达 | 第70-71页 |
| ·双萤光素酶试验 | 第71-72页 |
| ·人BMPR2基因5′侧翼重复序列簇集区及启动序列嵌合体报告质粒的构建 | 第72-74页 |
| ·人BMPR2基因5′侧翼重复序列簇集区与启动序列嵌合体报告质粒的萤光素酶实验 | 第74页 |
| ·结果 | 第74-83页 |
| ·人BMPR2基因5′侧翼大片段的克隆 | 第74-76页 |
| ·缺失体报告载体的构建 | 第76-77页 |
| ·各缺失体片段驱动的萤光素酶活性 | 第77-80页 |
| ·人BMPR2基因5′侧翼重复序列簇集区及启动序列嵌合体报告质粒的构建 | 第80-82页 |
| ·嵌合体报告质粒的萤光素酶活性 | 第82-83页 |
| ·讨论 | 第83-90页 |
| ·本部分小结 | 第90-91页 |
| 第四部分 人BMPR2基因近转录起始位点GC丰富区对SP1的反应 | 第91-117页 |
| ·材料 | 第91-92页 |
| ·方法 | 第92-101页 |
| ·SP1真核表达载体pcDNA3.1(+)-SP1的构建 | 第92-95页 |
| ·SP1对报告质粒pRL-TK及pGL3-Basic-S5(含人BMPR2启动子)的转录激活作用 | 第95-97页 |
| ·潜在转录因子SP1结合位点突变体报告质粒的构建 | 第97-99页 |
| ·突变体报告质粒的转染及萤光素酶实验 | 第99页 |
| ·电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA) | 第99-101页 |
| ·结果 | 第101-107页 |
| ·SP1真核表达载体的构建 | 第101-103页 |
| ·SP1对启动子的激活作用 | 第103-104页 |
| ·突变体报告质粒构建 | 第104-106页 |
| ·突变对人BMPR2基因启动子活性的影响 | 第106页 |
| ·电泳迁移率变动分析 | 第106-107页 |
| ·讨论 | 第107-116页 |
| ·本部分小结 | 第116-117页 |
| 第五部分 人BMPR2基因5′前导序列中GGC三核苷酸重复的多态性检测及功能研究 | 第117-148页 |
| ·材料 | 第117-119页 |
| ·菌种、载体和细胞系 | 第117页 |
| ·主要试剂 | 第117-118页 |
| ·主要工作液配制 | 第118-119页 |
| ·主要仪器 | 第119页 |
| ·方法 | 第119-135页 |
| ·GGC三核苷酸重复序列多态性检测 | 第119-124页 |
| ·GGC三核苷酸重复序列突变报告质粒的构建及萤光素酶实验 | 第124-126页 |
| ·GGC所在CpG岛甲基化状况的检测 | 第126-130页 |
| ·荧光定量PCR检测BMPR2基因mRNA表达水平 | 第130-135页 |
| ·结果 | 第135-143页 |
| ·GGC三核苷酸重复序列的多态性 | 第135-136页 |
| ·GGC三核苷酸重复序列突变报告质粒的构建及萤光素酶实验 | 第136-138页 |
| ·BMPR2基因GGC重复所在CpG岛甲基化检测结果 | 第138-140页 |
| ·荧光定量PCR检测BMPR2基因mRNA表达水平 | 第140-143页 |
| ·讨论 | 第143-147页 |
| ·关于GGC三核苷酸重复的多态性 | 第143-144页 |
| ·GGC12野生型和突变体报告质粒的萤光素酶活性 | 第144-145页 |
| ·关于BMPR2基因GGC重复区所在CpG岛甲基化状态与基因表达水平之间的关系 | 第145-147页 |
| ·本部分小结 | 第147-148页 |
| 全文总结及展望 | 第148-150页 |
| 参考文献 | 第150-169页 |
| 在学期间发表论文及参与课题 | 第169-170页 |
| 致谢 | 第170页 |
