| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 文献综述 | 第12-46页 |
| 第一章 植物口服疫苗的原理及其研究现状 | 第12-36页 |
| 1: 口服疫苗的免疫原理 | 第12-16页 |
| ·口服疫苗的免疫机制 | 第12-16页 |
| ·粘膜免疫应答的效应 | 第16页 |
| ·公共粘膜免疫系统的响应 | 第16页 |
| 2: 植物作为口服疫苗的生产优势 | 第16-17页 |
| 3: 植物口服疫苗的生产流程 | 第17-19页 |
| 4: 植物表达系统 | 第19-26页 |
| ·植物品种的选择 | 第19-21页 |
| ·植物生产系统的选择 | 第21-24页 |
| ·植物细胞培养 | 第22-23页 |
| ·植物组织培养 | 第23页 |
| ·整株植物 | 第23-24页 |
| ·表达系统的选择 | 第24-26页 |
| ·稳定整合表达 | 第25-26页 |
| ·植物病毒瞬间表达 | 第26页 |
| 5.利用植物表达系统可以生产的疫苗种类 | 第26-27页 |
| ·传染性疾病的疫苗 | 第26-27页 |
| ·自主免疫性疾病的疫苗 | 第27页 |
| ·人肿瘤疫苗 | 第27页 |
| 6: 植物疫苗目前的主要生产种类和临床研究状况 | 第27-29页 |
| ·产肠毒素型大肠杆菌疫苗 | 第27-28页 |
| ·乙肝病毒疫苗 | 第28页 |
| ·诺瓦克病毒疫苗 | 第28-29页 |
| ·狂犬病毒疫苗 | 第29页 |
| 7.植物口服疫苗的安全性与公众关注 | 第29-30页 |
| 8.植物疫苗的未来前景 | 第30-31页 |
| 参考文献 | 第31-36页 |
| 第二章 植物乙肝疫苗的生产和免疫呈递方式研究进展 | 第36-46页 |
| 1.口服递呈方式的选择 | 第37页 |
| 2.乙肝口服疫苗的植物表达系统标准 | 第37-38页 |
| 3.乙肝抗原的植物表达体系 | 第38-41页 |
| 4.植物组织表达的乙肝主要表面抗原的特征 | 第41页 |
| 5.植物组织表达的乙肝主要表面抗原的免疫效果 | 第41-42页 |
| 6.植物组织表达的乙肝主要表面抗原的临床试验 | 第42页 |
| 7.展望 | 第42-46页 |
| 本研究立题依据和意义 | 第46-49页 |
| 试验部分 | 第49-120页 |
| 第一章 利用大肠杆菌偏爱密码子的乙型肝炎病毒preS1基因的合成及其表达 | 第49-62页 |
| 前言 | 第49页 |
| 1 材料和方法 | 第49-53页 |
| ·材料 | 第50页 |
| ·菌株和质粒 | 第50页 |
| ·工具酶及其它生物学试剂 | 第50页 |
| ·方法 | 第50-53页 |
| ·adr血清型preS1基因改造和合成 | 第50-51页 |
| ·spreS1基因原核表达载体pET30S1的构建 | 第51-52页 |
| ·重组蛋白His6preS1的表达 | 第52页 |
| ·重组蛋白His6preS1的纯化 | 第52-53页 |
| ·重组蛋白His6preS1的抗原性分析 | 第53页 |
| 2 结果和讨论 | 第53-59页 |
| ·利用大肠杆菌密码子偏爱性进行preS1基因的人工合成 | 第53-56页 |
| ·原核表达载体pET30S1的构建 | 第56-57页 |
| ·preS1蛋白的表达与纯化 | 第57-58页 |
| ·重组蛋白的抗原性 | 第58-59页 |
| 3.小结 | 第59页 |
| 参考文献: | 第59-62页 |
| 第二章 新型乙肝抗原基因SS1在水稻种子中的特异表达及免疫原性研究 | 第62-95页 |
| 前言 | 第62-63页 |
| 1 材料和方法 | 第63-74页 |
| ·实验材料 | 第63页 |
| ·菌株和质粒 | 第63页 |
| ·植物材料 | 第63页 |
| ·工具酶及生物学试剂 | 第63页 |
| ·方法 | 第63-74页 |
| ·水稻基因组DNA的分离 | 第63-64页 |
| ·表达载体构建 | 第64-67页 |
| ·GluB-4启动子和GluB-1信号肽编码核苷酸融合DNA片段的克隆 | 第64-65页 |
| ·新型乙肝抗原基因SS1的改造与克隆 | 第65页 |
| ·GluB-1基因3′ UTR区克隆 | 第65-66页 |
| ·植物双元表达载体p1300GSS1的构建 | 第66-67页 |
| ·植物双元表达载体p1300GSS1的农杆菌EHA105的转化 | 第67页 |
| ·农杆菌EHA105电击感受态细胞的制备 | 第67页 |
| ·电击法转化 | 第67页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第67页 |
| ·水稻愈伤的遗传转化 | 第67-69页 |
| ·培养基组成 | 第67-68页 |
| ·水稻愈伤的准备 | 第68-69页 |
| ·农杆菌感染 | 第69页 |
| ·转基因植株的鉴定 | 第69页 |
| ·转基因植株的southern blotting分析 | 第69-71页 |
| ·转基因植株的RNA dot blotting分析 | 第71页 |
| ·Trizol法提取植物总RNA | 第71页 |
| ·点膜 | 第71页 |
| ·Western blot分析 | 第71-72页 |
| ·膜转移Western blot分析 | 第71-72页 |
| ·In Situ Western Blotting Hybridization分析 | 第72页 |
| ·重组蛋白的表达水平的初步分析 | 第72-73页 |
| ·蛋白浓度的标准曲线的绘制及成熟种子总可溶蛋白浓度的测定 | 第72-73页 |
| ·重组蛋白的表达水平测定 | 第73页 |
| ·重组蛋白的特征分析 | 第73-74页 |
| ·CsCl等密度梯度离心 | 第73页 |
| ·免疫电镜观察 | 第73-74页 |
| ·重组蛋白的对小鼠的免疫原性分析 | 第74页 |
| ·动物免疫试验 | 第74页 |
| ·免疫小鼠的抗血清分析 | 第74页 |
| 2 结果与讨论 | 第74-91页 |
| ·水稻胚乳特异性表达载体的构建 | 第74-81页 |
| ·水稻的遗传转化 | 第81-83页 |
| ·转化植株的筛选 | 第83-84页 |
| ·转基因植株的southern blotting和RNA dot blotting分析 | 第84-85页 |
| ·SS1蛋白在转基因水稻种子中表达量分析 | 第85-87页 |
| ·转基因水稻种子中表达量的SS1蛋白抗原性分析 | 第87-88页 |
| ·转基因水稻种子中表达量的SS1蛋白理化特性分析 | 第88-89页 |
| ·转基因水稻种子中表达量的SS1蛋白的动物免疫原性分析 | 第89-91页 |
| 3.小结 | 第91页 |
| 参考文献 | 第91-95页 |
| 第三章 新型乙肝抗原基因SS1在烟草叶绿体中的表达及抗原性分析 | 第95-120页 |
| 前言 | 第95-96页 |
| 1 材料和方法 | 第96-104页 |
| ·材料 | 第96页 |
| ·植物材料 | 第96页 |
| ·菌株和质粒 | 第96页 |
| ·工具酶及生物学试剂 | 第96页 |
| ·试验方法 | 第96-104页 |
| ·烟草叶绿体表达载体构建 | 第96-98页 |
| ·筛选标记基因aadA的启动子的克隆 | 第96-97页 |
| ·表达载体的整合 | 第97页 |
| ·新型乙肝抗原基因SS1的改造与克隆 | 第97-98页 |
| ·基因枪转化 | 第98-99页 |
| ·烟草无菌苗的培养和继代 | 第98页 |
| ·烟草受体细胞的准备 | 第98页 |
| ·微粒子弹(DNA coated microprojectiles)的制备 | 第98-99页 |
| ·装备基因枪 | 第99页 |
| ·轰击 | 第99页 |
| ·转化抗性植株的获得及同质化筛选 | 第99-100页 |
| ·过渡培养 | 第99页 |
| ·抗性筛选培养 | 第99-100页 |
| ·同质化筛选 | 第100页 |
| ·转基因植株的鉴定 | 第100-101页 |
| ·烟草叶绿体DNA提取(高离子强度低pH法) | 第100页 |
| ·转基因植株的PCR鉴定 | 第100-101页 |
| ·转基因植株的同质化分析 | 第101-102页 |
| ·利用实时荧光定量PCR对T0代植株进行同质化分析 | 第101-102页 |
| ·利用semi-quantitive PCR进行同质化程度分析 | 第102页 |
| ·利用复合PCR进行同质化的鉴定 | 第102页 |
| ·Northern blot分析 | 第102-103页 |
| ·Trizol法提取植物总RNA | 第102-103页 |
| ·转膜 | 第103页 |
| ·杂交和显影(参照上一章) | 第103页 |
| ·蛋白质分析 | 第103-104页 |
| ·蛋白的提取 | 第103-104页 |
| ·蛋白浓度的标准曲线的绘制和总可溶蛋白浓度的测定 | 第104页 |
| ·表达重组蛋白的相对表达水平测定 | 第104页 |
| 2 结果与讨论 | 第104-117页 |
| ·表达载体的构建与鉴定 | 第104-108页 |
| ·基因枪转化和同质化植株的获得 | 第108-110页 |
| ·转基因植株的鉴定 | 第110-111页 |
| ·转基因植株的同质化的鉴定 | 第111-115页 |
| ·外源基因的转录分析 | 第115-116页 |
| ·外源基因的表达分析 | 第116-117页 |
| 3.小结 | 第117页 |
| 参考文献: | 第117-120页 |
| 结论与展望 | 第120-122页 |
| 附 免疫佐剂分子霍乱毒素B亚单位(CTB)在大肠杆菌中的表达及分析 | 第122-134页 |
| 前言 | 第122页 |
| 1 材料和方法 | 第122-126页 |
| ·材料 | 第122-123页 |
| ·菌株和质粒 | 第123页 |
| ·工具酶及其它生物学试剂 | 第123页 |
| ·方法 | 第123-126页 |
| ·古典型霍乱弧菌基因组DNA的制备 | 第123页 |
| ·CTB基因的克隆 | 第123-124页 |
| ·CTB基因原核表达载体构建 | 第124页 |
| ·CTB基因的诱导表达 | 第124-125页 |
| ·CTB表达的包涵体蛋白纯化 | 第125页 |
| ·CTB蛋白的Western blotting检测 | 第125-126页 |
| ·CTB的体外生物活性分析 | 第126页 |
| 2 结果与讨论 | 第126-131页 |
| ·CTB基因的克隆与序列分析 | 第126-127页 |
| ·CTB基因原核表达载体的构建与鉴定 | 第127-128页 |
| ·CTB基因的诱导表达与包函体的纯化 | 第128-129页 |
| ·CTB重组蛋白的Western印迹检测 | 第129-130页 |
| ·CTB蛋白体外生物活性检测 | 第130-131页 |
| 3.小结 | 第131-132页 |
| 参考文献: | 第132-134页 |
| 在读期间发表论文 | 第134-136页 |
| 致谢 | 第136-137页 |
