| 中文摘要 | 第1-14页 |
| 英文摘要 | 第14-19页 |
| 前言 | 第19-22页 |
| 1.植酸酶概述 | 第19-20页 |
| 2.植酸酶研究存在的问题 | 第20页 |
| 3.本研究前期工作基础 | 第20-21页 |
| 4.本研究目的及意义 | 第21-22页 |
| 第一章 优化设计中性植酸酶phyC基因和phyA~m-phyCs融合基因的生物学信息分析 | 第22-41页 |
| 摘要 | 第22-23页 |
| 1 引言 | 第23页 |
| 2 材料和方法 | 第23-25页 |
| ·材料 | 第23页 |
| ·方法 | 第23-25页 |
| ·选用分析软件并确定分析优化方案 | 第23-25页 |
| ·分析中性植酸酶phyC基因 | 第25页 |
| ·优化设计中性植酸酶phyC基因 | 第25页 |
| 3 结果 | 第25-39页 |
| ·分析优化方案的确定 | 第25页 |
| ·中性植酸酶phyC基因的生物学信息分析 | 第25-30页 |
| ·氨基酸、碱基含量及密码子偏爱性 | 第25-27页 |
| ·phyC基因的mRNA二级结构及自由能 | 第27-30页 |
| ·phyC基因mRNA的起始密码子旁侧序列 | 第30页 |
| ·优化中性植酸酶phyCs基因的生物学信息分析 | 第30-34页 |
| ·碱基含量及密码子偏爱性 | 第30-31页 |
| ·phyCs基因的mRNA二级结构及自由能 | 第31-34页 |
| ·phyCs基因mRNA的起始密码子旁侧序列 | 第34页 |
| ·优化中性植酸酶phyCs基因的合成 | 第34-36页 |
| ·合成phyCs基因序列 | 第34页 |
| ·中性植酸酶蛋白的糖基化位点预测 | 第34-36页 |
| ·酸性植酸酶phyA~m与中性植酸酶phyCs融合基因的生物学信息分析 | 第36-39页 |
| ·融合植酸酶基因phyA~m-phyCsmRNA的起始密码子旁侧序列 | 第36-37页 |
| ·融合植酸酶蛋白的糖基化位点预测 | 第37-39页 |
| 4 讨论 | 第39-40页 |
| 5 小结 | 第40-41页 |
| 第二章 优化设计人工合成中性植酸酶phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的表达 | 第41-57页 |
| 摘要 | 第41-42页 |
| 1 引言 | 第42页 |
| 2 材料与方法 | 第42-50页 |
| ·材料 | 第42-46页 |
| ·质粒与菌株 | 第42-44页 |
| ·主要试剂 | 第44页 |
| ·培养基 | 第44-45页 |
| ·植酸酶活性测定溶液 | 第45页 |
| ·SDS-PAGE电泳药品及试剂 | 第45页 |
| ·主要仪器及耗材 | 第45-46页 |
| ·方法 | 第46-50页 |
| ·中性植酸酶phyCs基因表达载体的构建 | 第46-47页 |
| ·中性植酸酶phyCs基因表达片断的获得 | 第46页 |
| ·pPIC9K载体质粒DNA的处理 | 第46页 |
| ·连接反应及转化 | 第46-47页 |
| ·阳性克隆的筛选及鉴定 | 第47页 |
| ·表达载体pPIC9K-phyCs的电击转化 | 第47-48页 |
| ·重组表达载体的线性化处理 | 第47页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第47-48页 |
| ·电击转化 | 第48页 |
| ·重组酵母的筛选 | 第48页 |
| ·中性植酸酶phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的表达 | 第48-49页 |
| ·重组酵母的诱导培养 | 第48页 |
| ·重组酵母的诱导培养表达植酸酶产物的活性测定 | 第48-49页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE检测 | 第49页 |
| ·重组酵母基因工程菌的发酵 | 第49-50页 |
| ·YPD斜面培养 | 第49-50页 |
| ·种子制备 | 第50页 |
| ·补料分批发酵条件控制 | 第50页 |
| 3 结果 | 第50-55页 |
| ·表达载体pPIC9K-phyCs的E.coli克隆阳性菌落的PCR筛选 | 第50-51页 |
| ·中性植酸酶phyCs基因表达载体pPIC9K-phyCs的鉴定 | 第51页 |
| ·重组载体的转化及重组酵母的筛选 | 第51-52页 |
| ·中性植酸酶phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的诱导表达 | 第52页 |
| ·重组酵母基因工程菌的摇瓶产酶曲线测定 | 第52-53页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第53页 |
| ·中性植酸酶重组酵母基因工程菌的液体发酵 | 第53-54页 |
| ·表达中性植酸酶蛋白的二级结构预测分析 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-56页 |
| 5 小结 | 第56-57页 |
| 第三章 优化设计的植酸酶phyCs基因与酸性植酸酶phyA~m基因在毕赤巴斯德酵母中的融合表达 | 第57-75页 |
| 摘要 | 第57-58页 |
| 1 引言 | 第58-59页 |
| 2 材料与方法 | 第59-66页 |
| ·材料 | 第59-60页 |
| ·质粒与菌株 | 第59页 |
| ·主要试剂 | 第59页 |
| ·培养基 | 第59页 |
| ·植酸酶活性测定溶液 | 第59页 |
| ·SDS-PAGE电泳药品及试剂 | 第59-60页 |
| ·主要仪器及耗材 | 第60页 |
| ·方法 | 第60-66页 |
| ·植酸酶phyA~m及phyCs基因的扩增 | 第60-61页 |
| ·引物设计 | 第60页 |
| ·PCR扩增植酸酶基因 | 第60-61页 |
| ·植酸酶phyA~m及phyCs基因表达片断的克隆及鉴定 | 第61页 |
| ·植酸酶phyA~m及phyCs基因融合表达中间载体的构建 | 第61-62页 |
| ·植酸酶phyCs基因表达片断的获得 | 第61页 |
| ·pPIC9K载体质粒DNA的处理 | 第61-62页 |
| ·连接反应及转化 | 第62页 |
| ·阳性克隆的筛选及鉴定 | 第62页 |
| ·植酸酶phyA~m及phyCs基因融合表达载体pPIC9K-phyA~mCs的构建 | 第62-63页 |
| ·植酸酶phyA~m基因表达片断的获得 | 第62页 |
| ·pPIC9K-phyCs载体质粒DNA的处理 | 第62页 |
| ·连接反应及转化 | 第62-63页 |
| ·阳性克隆的筛选及鉴定 | 第63页 |
| ·表达载体pPIC9K-phyA~mCs的电击转化 | 第63-64页 |
| ·重组表达载体的线性化处理 | 第63页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第63页 |
| ·电击转化 | 第63-64页 |
| ·重组酵母的筛选 | 第64页 |
| ·植酸酶phyA~m及phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的融合表达 | 第64-65页 |
| ·重组酵母的诱导培养 | 第64页 |
| ·重组酵母的诱导培养表达植酸酶产物的活性测定 | 第64页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE检测 | 第64-65页 |
| ·重组酵母基因工程菌的发酵 | 第65-66页 |
| ·YPD斜面培养 | 第65页 |
| ·种子制备 | 第65页 |
| ·补料分批发酵条件控制 | 第65-66页 |
| 3 结果 | 第66-73页 |
| ·植酸酶phyA~m及phyCs基因的扩增 | 第66页 |
| ·植酸酶phyA~m-phyCs基因融合表达载体的构建 | 第66-67页 |
| ·重组载体的转化及重组酵母的筛选 | 第67-68页 |
| ·植酸酶phyA~m-phyCs融合基因在毕赤巴斯德酵母中的诱导表达 | 第68页 |
| ·重组酵母基因工程菌摇瓶产酶曲线的测定 | 第68-69页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE | 第69页 |
| ·融合植酸酶重组酵母基因工程菌的液体发酵 | 第69-70页 |
| ·表达融合植酸酶的结构预测分析 | 第70-73页 |
| 4 讨论 | 第73-74页 |
| 5 小结 | 第74-75页 |
| 第四章 重组植酸酶的纯化及最适反应温度、热稳定性、最适反应pH等酶学性质的测定 | 第75-92页 |
| 摘要 | 第75-76页 |
| 1 引言 | 第76页 |
| 2 材料和方法 | 第76-80页 |
| ·材料 | 第76-78页 |
| ·植酸酶重组基因工程菌株 | 第76-77页 |
| ·主要试剂 | 第77页 |
| ·培养基 | 第77页 |
| ·植酸酶活性测定溶液 | 第77页 |
| ·植酸酶纯化缓冲液 | 第77页 |
| ·主要仪器 | 第77-78页 |
| ·方法 | 第78-80页 |
| ·中性植酸酶的纯化 | 第78页 |
| ·融合植酸酶的纯化 | 第78-79页 |
| ·纯化植酸酶的SDS-PAGE | 第79页 |
| ·植酸酶的热稳定性的测定 | 第79页 |
| ·植酸酶的最适pH值的测定 | 第79页 |
| ·纯化植酸酶的去糖基化 | 第79-80页 |
| ·植酸酶的最适反应温度测定 | 第80页 |
| 3 结果 | 第80-89页 |
| ·表达产物的纯化 | 第80-81页 |
| ·重组中性植酸酶的纯化 | 第80-81页 |
| ·重组融合植酸酶的纯化 | 第81页 |
| ·纯化产物的SDS-PAGE | 第81-82页 |
| ·重组中性植酸酶的SDS-PAGE | 第81-82页 |
| ·重组融合植酸酶的SDS-PAGE | 第82页 |
| ·表达产物热稳定性的测定 | 第82-84页 |
| ·表达中性植酸酶的热稳定性 | 第82-83页 |
| ·表达融合植酸酶的热稳定性 | 第83-84页 |
| ·表达产物最适反应pH的测定 | 第84-86页 |
| ·表达中性植酸酶的最适反应pH | 第84页 |
| ·表达融合植酸酶的最适反应pH | 第84-86页 |
| ·表达产物最适反应温度的测定 | 第86-87页 |
| ·表达中性植酸酶的最适反应温度 | 第86页 |
| ·表达融合植酸酶的最适反应温度 | 第86-87页 |
| ·表达产物的去糖基化 | 第87-89页 |
| ·表达中性植酸酶的去糖基化 | 第87-88页 |
| ·表达酸性植酸酶的去糖基化 | 第88页 |
| ·表达融合植酸酶的去糖基化 | 第88-89页 |
| 4 讨论 | 第89-91页 |
| 5 小结 | 第91-92页 |
| 结论 | 第92-94页 |
| 文献综述 | 第94-114页 |
| 参考文献 | 第114-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
| 博士在读期间发表论文等情况 | 第126-127页 |
