| 目录 | 第1-8页 |
| 缩写词 | 第8-10页 |
| 摘要 | 第10-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 前言 | 第16-33页 |
| 1 糖尿病与新型抗糖尿病药物的发现 | 第16-19页 |
| 2 AMPK与Ⅱ型糖尿病 | 第19-30页 |
| 3 研究意义 | 第30-33页 |
| 第一部分 HsAMPK-α1催化亚基的表达、纯化及性质研究 | 第33-65页 |
| 1 材料与方法 | 第33-42页 |
| ·实验材料 | 第33-35页 |
| ·实验方法 | 第35-42页 |
| ·pET42b-HsAMPK-α1(312)、pGEX-HsAMPK-α1(FL)表达质粒的构建 | 第35-37页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第37-38页 |
| ·GST-HsAMPK-α1(312)及HsAMPK-α1(312)的纯化 | 第38-39页 |
| ·GST-HsAMPK-α1(FL)及HsAMPK-α1(FL)的纯化 | 第39-40页 |
| ·MBP-CaMKKβ(用pMAL-CaMKKβ重组质粒表达)的纯化 | 第40页 |
| ·其它方法 | 第40-42页 |
| 2 结果 | 第42-59页 |
| ·HsAMPK-α1基因的获得 | 第42-43页 |
| ·HsAMPK-α1表达质粒的构建 | 第43-44页 |
| ·HsAMPK-α1的表达和纯化 | 第44-49页 |
| ·MBP-CaMKKβ的表达和纯化 | 第49-50页 |
| ·HsAMPK-α1(312)的预磷酸化 | 第50页 |
| ·MBP-CaMKKβ对GST-HsAMPK-α1(312)活性的影响及四种HsAMPK-α1蛋白活性的比较 | 第50-53页 |
| ·双底物对HsAMPK-α1(312)激酶活性的影响及GST-HsAMPK-α1(312)和HsAMPK-α1(312)的酶动力学性质比较 | 第53-55页 |
| ·pH对HsAMPK-α1(312)激酶活性的影响 | 第55-56页 |
| ·AMP、MgCl_2及DTT对HsAMPK-α1(312)活性的影响 | 第56-59页 |
| 3 讨论 | 第59-65页 |
| 第二部分 高通量药物筛选分子模型的建立 | 第65-93页 |
| 1 基于放射性同位素方法建立的分子水平高通量筛选模型 | 第65-75页 |
| ·材料与方法 | 第65-68页 |
| ·实验材料 | 第65-66页 |
| ·实验方法 | 第66-68页 |
| ·筛选中较适酶浓度的确定 | 第66页 |
| ·HsAMPK-α1(312)对底物磷酸化时线性反应时间的确定 | 第66页 |
| ·筛选中DMSO对酶活性的影响 | 第66-67页 |
| ·高通量抑制剂筛选 | 第67-68页 |
| ·结果 | 第68-73页 |
| ·药物筛选中较适酶浓度的确定 | 第68-69页 |
| ·HsAMPK-α1(312)对底物磷酸化时线性反应时间的确定 | 第69-70页 |
| ·筛选中DMSO的影响 | 第70-71页 |
| ·用于高通量筛选的HsAMPK-α1(312)测活条件的优化 | 第71页 |
| ·高通量抑制剂筛选 | 第71-73页 |
| ·讨论 | 第73-75页 |
| 2 基于荧光偏振方法建立均相分子水平高通量筛选模型 | 第75-93页 |
| ·材料与方法 | 第75-79页 |
| ·实验材料 | 第75-76页 |
| ·实验方法 | 第76-79页 |
| ·基于ATPγS荧光偏振方法的建立 | 第76-78页 |
| ·Iodoacetyl-LC-biotin浓度的确定 | 第76页 |
| ·Streptavidin浓度的确定 | 第76-77页 |
| ·酶浓度及反应时间对酶促反应的影响 | 第77页 |
| ·底物ATPγS对酶促反应的影响 | 第77页 |
| ·AMP、MgCl_2对酶促反应的影响 | 第77-78页 |
| ·基于硫酸锌荧光偏振方法的建立 | 第78-79页 |
| ·酶浓度的影响 | 第78页 |
| ·ATP的影响 | 第78页 |
| ·AMP的影响 | 第78-79页 |
| ·pH值对酶活性的影响 | 第79页 |
| ·结果 | 第79-91页 |
| ·基于ATPγS荧光偏振方法的建立 | 第79-87页 |
| ·Iodoacetyl-LC-biotin浓度的确定 | 第81页 |
| ·Streptavidin浓度的确定 | 第81-82页 |
| ·酶浓度及反应时间对酶促反应的影响 | 第82-84页 |
| ·双底物F-SAMS及ATPγS对酶促反应的影响 | 第84-85页 |
| ·AMP、MgCl_2对酶促反应的影响 | 第85-87页 |
| ·基于硫酸锌荧光偏振方法的建立 | 第87-91页 |
| ·酶浓度的影响 | 第87-88页 |
| ·ATP的影响 | 第88-89页 |
| ·AMP的影响 | 第89-90页 |
| ·pH值对酶活性的影响 | 第90-91页 |
| ·讨论 | 第91-93页 |
| 总结 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-101页 |
| 附录 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102页 |
