| 摘要 | 第1-6页 |
| 目录 | 第6-10页 |
| 一、引言 | 第10-13页 |
| 二、材料与方法 | 第13-40页 |
| 1 菌株与质粒 | 第13页 |
| 2 引物、酶和主要生化试剂 | 第13-15页 |
| 3 基本的实验技术和方法 | 第15-18页 |
| ·细菌培养 | 第15-16页 |
| ·质粒DNA的抽提 | 第16-17页 |
| ·感受态细胞制备和重组质粒的转化 | 第17页 |
| ·从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA | 第17-18页 |
| 4 根瘤菌总DNA的抽提 | 第18-19页 |
| ·根瘤菌总DNA的小量抽提 | 第18-19页 |
| ·根瘤菌总DNA的大量抽提 | 第19页 |
| 5 Southern杂交 | 第19-22页 |
| ·切口平移法标记hurL基因探针 | 第19-20页 |
| ·将DNA转移到尼龙膜 | 第20-22页 |
| ·放射性标记的探针与固定于尼龙膜上的DNA进行杂交 | 第22页 |
| 6 豌豆根瘤菌基因组hurL基因的克隆及序列分析 | 第22-24页 |
| ·豌豆根瘤菌基因组DNA PstI酶切片段3.0-3.2 kb部分文库的构建 | 第22-23页 |
| ·利用斑点杂交的方法从根瘤菌基因组DNA部分文库中筛选含hurL阳性克隆 | 第23-24页 |
| ·阳性克隆的PCR验证及序列分析 | 第24页 |
| ·DNA序列分析及同源性比较 | 第24页 |
| 7 根瘤菌RNA的抽提 | 第24-26页 |
| ·RNA专用仪器的预处理 | 第24页 |
| ·水饱和酚的配制 | 第24-25页 |
| ·根瘤菌RNA的抽提 | 第25-26页 |
| ·RNA的甲醛变性电泳 | 第26页 |
| 8 引物延伸方法确定hurL基因的转录启始位点 | 第26-28页 |
| ·引物P-1061的标记 | 第26页 |
| ·根瘤菌总RNA与引物退火，延伸反应 | 第26-28页 |
| ·DNA的测序 | 第28页 |
| 9 hurL启动子与lacZ融合表达质粒的构建 | 第28-29页 |
| 10 三亲本杂交 | 第29-30页 |
| 11 β-半乳糖苷酶的测定 | 第30-31页 |
| ·试剂配制 | 第30页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性测定 | 第30-31页 |
| 12 豌豆根瘤菌hurL突变株的构建 | 第31-34页 |
| ·含插入了卡那霉素抗性片段的hurL基因的重组质粒的构建 | 第31-32页 |
| ·含卡那霉素抗性基因的DNA片段的制备 | 第31-32页 |
| ·PCR方法在hurL基因中引入适当(XbaI)酶切位点 | 第32页 |
| ·含插入了卡那霉素抗性片段的hurL基因的重组质粒的构建 | 第32页 |
| ·豌豆根瘤菌hurL突变株的构建 | 第32-33页 |
| ·豌豆根瘤菌hurL基因卡那霉素抗性插入突变菌株的验证 | 第33-34页 |
| ·PCR方法验证 | 第33页 |
| ·Southern杂交方法验证 | 第33-34页 |
| 13 hurL突变互补菌株的构建 | 第34-35页 |
| ·根瘤菌电转化感受态细胞的制备 | 第34-41534页 |
| ·含hurL基因DNA片段克隆于广宿主质粒pRK | 第41534-34页 |
| ·电转化构建hurL突变互补菌株 | 第34-35页 |
| 14 根瘤菌生长曲线的测定 | 第35页 |
| 15 根瘤菌活菌数的测定 | 第35页 |
| 16 根瘤菌对紫外线敏感性的测定 | 第35-36页 |
| 17 根瘤菌细胞粗提物的制备 | 第36页 |
| 18 凝胶延滞 | 第36-37页 |
| 19 结瘤基因表达报告质粒的构建 | 第37页 |
| 20 含多拷贝hurL基因的根瘤菌菌株的构建 | 第37-38页 |
| 21 豌豆根瘤菌在宿主植物上的结瘤试验 | 第38-40页 |
| ·植物种子的灭菌与萌发 | 第38-39页 |
| ·结瘤实验 | 第39-40页 |
| 三、 实验结果 | 第40-71页 |
| 1 豌豆根瘤菌基因组中只含单一种类和单一拷贝的hurL基因 | 第40-41页 |
| 2 豌豆根瘤菌染色体hurL基因文库的构建 | 第41-43页 |
| 3 从豌豆根瘤菌染色体hurL基因文库中筛选hurL基因阳性克隆 | 第43-45页 |
| 4 重组质粒pUP33中含hurL基因的3.1 kb PstI外源片段的核苷酸序列分析 | 第45-49页 |
| 5 R. leguminosarum bv. viciae HurL与其它种类微生物同源蛋白之间的同源性比较 | 第49-50页 |
| 6 引物延伸方法确定hurL基因的转录起始位点 | 第50-52页 |
| 7 hurL基因在豌豆根瘤菌体内转录的研究 | 第52-54页 |
| 8 豌豆根瘤菌hurL突变株的构建 | 第54-56页 |
| 9 豌豆根瘤菌hurL突变株M704的验证 | 第56-58页 |
| 10 豌豆根瘤菌hurL突变株的生长表型 | 第58-61页 |
| 11 豌豆根瘤菌hurL突变株对紫外线的敏感性 | 第61-62页 |
| 12 豌豆根瘤菌hurL突变株M704在宿主植物Pisum sativum cv. Frisson(豌豆)和 Vicia hirsuta(野豌豆)上的结瘤表型 | 第62-64页 |
| 13 豌豆根瘤菌hurL突变株中NodD蛋白产量测定 | 第64-66页 |
| 14 豌豆根瘤菌hurL基因突变对结瘤基因表达的影响 | 第66-68页 |
| 15 增加豌豆根瘤菌体内hurL基因拷贝数对结瘤基因转录表达的影响 | 第68-71页 |
| 四、 讨论 | 第71-77页 |
| 1 豌豆根瘤菌HurL与其它细菌HU类蛋白有很高的同源性 | 第71页 |
| 2 豌豆根瘤菌hurL基因位于其染色体DNA上 | 第71-72页 |
| 3 豌豆根瘤菌hurL基因在体内作为一个单独的启动子转录 | 第72-73页 |
| 4 hurL基因在豌豆根瘤菌体内表达的不稳定性 | 第73页 |
| 5 hurL基因参与nodD基因的转录调控 | 第73-74页 |
| 6 hurL基因参与调节其它结瘤基因的表达 | 第74-75页 |
| 7 豌豆根瘤菌hurL基因影响根瘤菌的生长 | 第75页 |
| 8 hurL基因突变影响豌豆根瘤菌在宿主植物上的结瘤 | 第75-77页 |
| 结语 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-87页 |
| 发表文章附录 | 第87-88页 |
| 致谢 | 第88页 |
