| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 缩略词表 | 第8-12页 |
| 1. 前言 | 第12-22页 |
| ·上皮间质转化概述 | 第13页 |
| ·E-钙粘素(E-cadherin)与EMT | 第13-15页 |
| ·E-cadherin的结构 | 第14页 |
| ·E-cadherin的功能 | 第14页 |
| ·E-cadherin与肿瘤 | 第14-15页 |
| ·Slug与EMT | 第15-17页 |
| ·Slug的结构 | 第15-16页 |
| ·Slug的功能 | 第16页 |
| ·Slug与肿瘤 | 第16-17页 |
| ·荧光蛋白报告基因概述 | 第17页 |
| ·慢病毒载体的概述 | 第17-19页 |
| ·慢病毒载体 | 第18页 |
| ·慢病毒载体的安全性 | 第18-19页 |
| ·实验方案设计 | 第19-22页 |
| ·课题来源 | 第19页 |
| ·课题目的和意义 | 第19页 |
| ·课题创新点、重点及难点 | 第19页 |
| ·载体构建策略及流程 | 第19-22页 |
| 2. 实验材料 | 第22-28页 |
| ·菌株及质粒 | 第22页 |
| ·细胞株系及培养条件 | 第22页 |
| ·生化试剂 | 第22-23页 |
| ·主要仪器与设备 | 第23-24页 |
| ·培养基及细胞培养液 | 第24-25页 |
| ·主要溶液的配制 | 第25-27页 |
| ·引物设计与合成 | 第27-28页 |
| 3. 实验方法 | 第28-45页 |
| ·慢病毒表达质粒Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP的构建 | 第28-34页 |
| ·E-cadherin启动子（简称pE-cad）的制备 | 第28-31页 |
| ·Hela细胞系全基因组的抽提 | 第28页 |
| ·E-cad启动子的PCR扩增 | 第28-30页 |
| ·pE-cad与pMD19-T Simple载体的连接、鉴定 | 第30-31页 |
| ·pE-cad-RFP/YFP/BFP载体的构建 | 第31-33页 |
| ·pE-cad与T-Linker片段的制备 | 第31-32页 |
| ·pE-cad与T-Linker片段的连接、筛选 | 第32页 |
| ·pE-cad-Linker与RFP/YFP/BFP片段的制备 | 第32-33页 |
| ·pE-cad-Linker与RFP/YFP/BFP片段的连接、筛选 | 第33页 |
| ·Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP载体的构建 | 第33-34页 |
| ·慢病毒骨架质粒 pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE 载体片段（简称Lv-PGK-GFP）与pE-cad-RFP/YFP/BFP片段的制备 | 第33页 |
| ·Lv-PGK-GFP载体片段与pE-cad-RFP/YFP/BFP片段的连接、筛选 | 第33-34页 |
| ·慢病毒表达质粒Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP的构建 | 第34-36页 |
| ·Slug启动子的制备 | 第34-35页 |
| ·Slug启动子（简称pSlug）的PCR扩增 | 第34-35页 |
| ·pSlug与pMD19-T Simple载体的连接、鉴定 | 第35页 |
| ·pSlug-RFP/YFP/BFP载体的构建 | 第35-36页 |
| ·pSlug与T-Linker片段的制备 | 第35页 |
| ·pSlug与T-Linker片段的连接、筛选 | 第35页 |
| ·pSlug-Linker与RFP/YFP/BFP片段的制备 | 第35页 |
| ·pSlug-Linker与RFP/YFP/BFP片段的连接、筛选 | 第35-36页 |
| ·Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP载体的构建 | 第36页 |
| ·Lv-PGK-GFP载体片段与pSlug -RFP/YFP/BFP片段的制备 | 第36页 |
| ·Lv-PGK-GFP载体片段与pSlug -RFP/YFP/BFP片段的连接、筛选 | 第36页 |
| ·慢病毒的包装 | 第36-39页 |
| ·慢病毒包装质粒与转移质粒的大量抽提 | 第36-37页 |
| ·细胞复苏 | 第37页 |
| ·细胞传代 | 第37页 |
| ·细胞计数 | 第37-38页 |
| ·细胞冻存 | 第38页 |
| ·病毒包装 | 第38-39页 |
| ·慢病毒的收集和纯化 | 第39页 |
| ·慢病毒的滴度测定 | 第39页 |
| ·检测慢病毒Lv-pE-cad- YFP的有效性 | 第39-45页 |
| ·慢病毒Lv-pE-cad- YFP对肝癌细胞系PLC/PRF/5 的感染 | 第39-40页 |
| ·流式细胞仪检测肝癌细胞系PLC/PRF/5 中YFP的表达以及分选出YFP阴性和阳性的细胞 | 第40页 |
| ·实时定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)技术检测基因表达差异29 | 第40-41页 |
| ·总RNA的提取 | 第40页 |
| ·cDNA的制备 | 第40-41页 |
| ·Real Time PCR技术检测相关基因的表达水平 | 第41页 |
| ·Western blotting 检测基因表达 | 第41-43页 |
| ·Transwell迁移实验 | 第43-44页 |
| ·检测TGF-β诱导前后细胞荧光表达差异 | 第44-45页 |
| 4. 实验结果与分析 | 第45-56页 |
| ·慢病毒表达质粒Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP载体构建结果 | 第45-47页 |
| ·E-cad启动子的扩增及鉴定 | 第45页 |
| ·克隆T-pE-cad的构建及鉴定 | 第45-46页 |
| ·克隆pE-cad-Linker的构建及鉴定 | 第46页 |
| ·克隆pE-cad-RFP/YFP/BFP的构建及鉴定 | 第46页 |
| ·克隆Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP的构建及鉴定 | 第46-47页 |
| ·慢病毒表达质粒Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP载体构建结果 | 第47-50页 |
| ·Slug启动子的扩增及鉴定 | 第47页 |
| ·克隆T-pSlug的构建及鉴定 | 第47-48页 |
| ·克隆pSlug-Linker的构建及鉴定 | 第48页 |
| ·克隆pSlug-RFP/YFP/BFP的构建及鉴定 | 第48-49页 |
| ·克隆Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP的构建及鉴定 | 第49-50页 |
| ·慢病毒的包装 | 第50-51页 |
| ·慢病毒Lv-pE-cad-YFP有效性的检测 | 第51-56页 |
| ·慢病毒Lv-pE-cad-YFP感染肝癌PLC/PRF/5 细胞 | 第51页 |
| ·流式细胞仪分选YFP阴性和YFP阳性的PLC/PRF/5 细胞 | 第51-52页 |
| ·qRT-PCR检测YFP阴性和YFP阳性的PLC/PRF/5 细胞中E-cad表达差异 | 第52页 |
| ·Western blotting 检测YFP阴性和YFP阳性的PLC/PRF/5 细胞中E-cad表达差异 | 第52-53页 |
| ·Transwell迁移实验检测YFP阴性和YFP阳性的PLC/PRF/5 细胞迁移能力差异 | 第53-54页 |
| ·检测TGF-β诱导对YFP阳性细胞阳性率的影响 | 第54-56页 |
| 5. 讨论 | 第56-58页 |
| 6. 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 附录 | 第65-66页 |
| 在学期间发表的论文 | 第66页 |
