| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-5页 |
| 英文缩写符号及中英文对照表 | 第5-6页 |
| 目录 | 第6-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-22页 |
| 1 植物的冻害及冻害机理 | 第9-11页 |
| ·冻害 | 第9-10页 |
| ·冻害机理 | 第10-11页 |
| 2 抗冻基因 | 第11-14页 |
| ·抗冻蛋白的来源及鱼类抗冻蛋白（AFP） | 第11-12页 |
| ·鱼类 AFP 及在农业中的应用 | 第12页 |
| ·植物抗冻蛋白 | 第12-13页 |
| ·植物 AFPs 基因的发现 | 第12-13页 |
| ·植物 AFP 基因在提高植物抗冻性方面的应用 | 第13页 |
| ·抗冻相关基因 | 第13-14页 |
| ·抗冻转录因子 CBF 家族的发现 | 第13-14页 |
| ·CBFs 与抗冻基因 | 第14页 |
| 3 葡萄遗传转化的研究 | 第14-20页 |
| ·葡萄再生体系的研究 | 第14-17页 |
| ·葡萄器官发生途径 | 第15-16页 |
| ·胚状体发生途径 | 第16-17页 |
| ·葡萄遗传转化途径的研究 | 第17-20页 |
| ·根癌农杆菌介导 Ti 质粒介导基因转化葡萄 | 第17-18页 |
| ·发根农杆菌转化葡萄 | 第18-19页 |
| ·基因枪法转化葡萄 | 第19页 |
| ·基因枪法和根癌农杆菌介导法相结合转化葡萄 | 第19-20页 |
| 4 本项目的研究目的和意义 | 第20-21页 |
| 5 技术路线 | 第21-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-34页 |
| 1 材料 | 第22-24页 |
| ·植物材料 | 第22页 |
| ·菌种与质粒 | 第22页 |
| ·酶与试剂 | 第22页 |
| ·PCR 引物的设计 | 第22页 |
| ·培养基 | 第22-23页 |
| ·细菌培养基 | 第22-23页 |
| ·缓冲液 | 第23-24页 |
| 2 方法 | 第24-28页 |
| ·抗冻基因 AFP 的克隆 | 第24-25页 |
| ·胡萝卜基因组总 DNA 的提取方法（CTAB 法） | 第24-25页 |
| ·抗冻蛋白 AFP 基因的扩增 | 第25页 |
| ·目的基因片段的回收 | 第25页 |
| ·目的片段与 pGEm-T easy Vector 载体的连接 | 第25-26页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第26-27页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第26页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第26-27页 |
| ·质粒 DNA 的提取 | 第27页 |
| ·重组质粒的滞后鉴定 | 第27页 |
| ·重组质粒的 PCR 鉴定 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定体系 | 第28页 |
| ·重组质粒的序列测序 | 第28页 |
| ·AFP 基因序列的生物信息学分析 | 第28页 |
| 3 抗冻基因 AFP 植物表达载体的构建 | 第28-31页 |
| ·质粒的酶切 | 第28-29页 |
| ·连接 AFP 和 pBI121 酶切产物 | 第29页 |
| ·转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 | 第29-30页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第30页 |
| ·中间载体直接导入农杆菌 | 第30页 |
| ·PCR 扩增 | 第30-31页 |
| 4 葡萄遗传转化 | 第31-34页 |
| ·葡萄遗传转化再生体系的诱导 | 第31-32页 |
| ·不同生长调节剂种类及浓度对葡萄遗传转化再生体系的影响 | 第31页 |
| ·不同糖分处理的试管苗对葡萄遗传转化再生体系的影响 | 第31页 |
| ·不同基因型对葡萄遗传转化再生体系的影响 | 第31-32页 |
| ·不定芽增殖 | 第32页 |
| ·根癌农杆菌介导胡萝卜 AFP 转化葡萄 | 第32-34页 |
| ·卡那霉素筛选浓度确定 | 第32页 |
| ·农杆菌浓度和时间对葡萄遗传转化的影响 | 第32页 |
| ·羧苄青霉素敏感性试验 | 第32页 |
| ·农杆菌叶盘法转化 | 第32-33页 |
| ·转基因植株的 PCR 鉴定 | 第33-34页 |
| 第三章 结果与分析 | 第34-46页 |
| 1 胡萝卜抗冻蛋白 AFP 基因克隆 | 第34-39页 |
| ·胡萝卜总 DNA 的提取与目的片段的 PCR 扩增及回收 | 第34-36页 |
| ·重组体的筛选 | 第34页 |
| ·重组质粒的滞后鉴定 | 第34-35页 |
| ·目的片段在重组质粒中的 PCR 鉴定 | 第35页 |
| ·目的片段的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| ·AFP 基因测序结果及核苷酸序列分析 | 第36-37页 |
| ·AFP 基因氨基酸序列同源性分析及分子进化分析 | 第37-38页 |
| ·蛋白一级结构特征及理化性质分析 | 第38-39页 |
| ·蛋白质二级结构预测 | 第39页 |
| 2. AFP 抗冻基因载体构建 | 第39-41页 |
| ·pGEM-AFP 和 pBI121 酶切 | 第40页 |
| ·植物表达载体的鉴定 | 第40-41页 |
| ·中间载体导入农杆菌的鉴定 | 第41页 |
| ·农杆菌的转化 | 第41页 |
| ·农杆菌转化的鉴定 | 第41页 |
| 3 葡萄遗传转化 | 第41-46页 |
| ·不同激素组合对葡萄再生体系的影响 | 第41-44页 |
| ·不同糖分处理的葡萄试管苗对不定芽分化的影响 | 第41-42页 |
| ·不同激素组合对葡萄再生体系的影响 | 第42-43页 |
| ·不同基因型对葡萄再生体系的影响 | 第43-44页 |
| ·葡萄转化 | 第44-46页 |
| ·卡那霉素筛选浓度确定 | 第44页 |
| ·菌液浓度和时间的选择 | 第44页 |
| ·羧苄青霉素敏感性筛选 | 第44-45页 |
| ·转化再生植株的 PCR 鉴定 | 第45-46页 |
| 第四章 讨论 | 第46-51页 |
| 1 胡萝卜 AFP 基因的进化关系 | 第46-47页 |
| 2 中间表达载体构建策略 | 第47页 |
| 3 影响葡萄遗传转化的因素 | 第47-51页 |
| ·外植体对再生体系的影响 | 第47-48页 |
| ·激素的种类和浓度 | 第48-49页 |
| ·影响葡萄转化的因素——菌液浓度和浸染时间 | 第49页 |
| ·抗性标记基因的影响 | 第49-51页 |
| 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-59页 |
| 图版说明 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
| 个人简历 | 第61-62页 |
| 导师简介 | 第62-63页 |
