| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8页 |
| 中英文缩写词表 | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-22页 |
| 1.1 CDV病原特性 | 第10-13页 |
| 1.1.1 分类地位 | 第10页 |
| 1.1.2 形态特征及分离培养 | 第10-11页 |
| 1.1.3 理化特性 | 第11页 |
| 1.1.4 基因组结构 | 第11-13页 |
| 1.1.4.1 核衣壳蛋白 | 第11-12页 |
| 1.1.4.2 L蛋白与P蛋白 | 第12页 |
| 1.1.4.3 M蛋白 | 第12页 |
| 1.1.4.4 F蛋白和H蛋白 | 第12-13页 |
| 1.2 致病机理 | 第13-15页 |
| 1.2.1 CDV组织嗜性 | 第13页 |
| 1.2.2 神经症状及其机理 | 第13-14页 |
| 1.2.3 免疫抑制机理 | 第14页 |
| 1.2.4 持续性感染 | 第14-15页 |
| 1.3 临床症状 | 第15-16页 |
| 1.4 诊断技术 | 第16-19页 |
| 1.4.1 病毒分离技术 | 第16页 |
| 1.4.1.1 病毒培养 | 第16页 |
| 1.4.1.2 电镜观察 | 第16页 |
| 1.4.1.3 动物回归试验 | 第16页 |
| 1.4.2 包涵体检测 | 第16-17页 |
| 1.4.3 荧光抗体技术 | 第17页 |
| 1.4.4 酶联免疫吸附试验（ELISA） | 第17页 |
| 1.4.5 胶体金免疫层析技术 | 第17页 |
| 1.4.6 RT-PCR | 第17-18页 |
| 1.4.7 实时荧光定量PCR | 第18页 |
| 1.4.8 环介导等温基因扩增技术 | 第18-19页 |
| 1.5 犬瘟热疫苗研制 | 第19-21页 |
| 1.5.1 灭活苗 | 第19页 |
| 1.5.2 麻疹病毒疫苗 | 第19页 |
| 1.5.3 弱毒疫苗 | 第19-20页 |
| 1.5.4 基因工程疫苗 | 第20-21页 |
| 1.5.4.1 亚单位疫苗 | 第20-21页 |
| 1.5.4.2 核酸疫苗 | 第21页 |
| 1.5.4.3 重组活载体疫苗 | 第21页 |
| 1.6 治疗 | 第21-22页 |
| 第二章 犬瘟热RT-PCR检测方法的建立 | 第22-33页 |
| 2.1 材料与方法 | 第22-27页 |
| 2.1.1 试验材料 | 第22页 |
| 2.1.2 试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.2.1 主要试剂 | 第22页 |
| 2.1.2.2 相关试剂配制 | 第22-23页 |
| 2.1.3 设备 | 第23页 |
| 2.1.4 方法 | 第23-27页 |
| 2.1.4.1 引物设计 | 第23页 |
| 2.1.4.2 RNA提取与c DNA模板制备 | 第23-24页 |
| 2.1.4.3 PCR反应体系及结果判定 | 第24页 |
| 2.1.4.4 重组质粒PMD18-T-CDVN构建与测序 | 第24-27页 |
| 2.1.4.5 敏感性试验 | 第27页 |
| 2.1.4.6 特异性试验 | 第27页 |
| 2.1.4.7 临床样品检测应用 | 第27页 |
| 2.2 结果 | 第27-31页 |
| 2.2.1 RT-PCR初步建立结果 | 第27页 |
| 2.2.2 退火温度优化试验结果 | 第27-28页 |
| 2.2.3 重组质粒PMD18-T-CDVN构建与测序结果 | 第28-30页 |
| 2.2.3.1 PMD18-T-CDVN PCR鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2.3.2 PMD18-T-CDVN双酶切鉴定 | 第29页 |
| 2.2.3.3 PMD18-T-CDVN测序结果 | 第29-30页 |
| 2.2.4 RT-PCR敏感性试验结果 | 第30页 |
| 2.2.5 RT-PCR特异性试验结果 | 第30-31页 |
| 2.2.6 临床应用结果 | 第31页 |
| 2.3 讨论 | 第31-32页 |
| 2.4 小结 | 第32-33页 |
| 第三章 犬瘟热病毒部分H基因的原核表达 | 第33-51页 |
| 3.1 材料与方法 | 第33-42页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第33页 |
| 3.1.2 试验CDV样品 | 第33页 |
| 3.1.3 生化试剂 | 第33页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第33-34页 |
| 3.1.5 培养基和部分试剂配制 | 第34页 |
| 3.1.6 质粒提取试剂配制 | 第34页 |
| 3.1.7 蛋白电泳相关溶液配制 | 第34-35页 |
| 3.1.8 蛋白纯化试剂配制 | 第35页 |
| 3.1.9 蛋白复性试剂配制 | 第35-36页 |
| 3.1.10 试验方法 | 第36-42页 |
| 3.1.10.1 引物设计 | 第36页 |
| 3.1.10.2 病毒RNA提取 | 第36页 |
| 3.1.10.3 RT-PCR | 第36-37页 |
| 3.1.10.4 H基因的克隆测序 | 第37-38页 |
| 3.1.10.5 重组表达质粒p ET32a-CDVH的构建 | 第38-39页 |
| 3.1.10.6 目的基因诱导表达 | 第39-40页 |
| 3.1.10.7 目的基因诱导表达条件优化 | 第40页 |
| 3.1.10.8 重组蛋白大量表达及初步纯化 | 第40-41页 |
| 3.1.10.9 重组H蛋白过柱纯化 | 第41页 |
| 3.1.10.10 重组H蛋白透析复性 | 第41-42页 |
| 3.1.10.11 重组H蛋白免疫小鼠试验 | 第42页 |
| 3.1.10.12 重组H蛋白免疫小鼠抗体效价检测 | 第42页 |
| 3.2 结果 | 第42-49页 |
| 3.2.1 重组质粒PMD19-T-CDVH构建 | 第42-43页 |
| 3.2.1.1 目的基因PCR扩增 | 第42-43页 |
| 3.2.1.2 重组质粒PMD19-T-CDVH双酶切鉴定 | 第43页 |
| 3.2.2 CDVH基因片段测序结果与分析 | 第43-45页 |
| 3.2.2.1 重组质粒CDV H基因片段测序结果 | 第43-44页 |
| 3.2.2.2 H基因同源性分析 | 第44页 |
| 3.2.2.3 进化树分析 | 第44-45页 |
| 3.2.3 重组质粒pET32a-CDVH双酶切电泳结果 | 第45页 |
| 3.2.4 诱导表达试验 | 第45-47页 |
| 3.2.4.1 IPTG浓度优化试验结果 | 第45-46页 |
| 3.2.4.2 最佳诱导表达时间试验 | 第46-47页 |
| 3.2.5 重组蛋白表达形式试验结果 | 第47页 |
| 3.2.6 蛋白纯化试验 | 第47-48页 |
| 3.2.6.1 包涵体洗涤初步纯化结果 | 第47-48页 |
| 3.2.6.2 Ni柱纯化结果 | 第48页 |
| 3.2.7 重组H蛋白免疫小鼠抗体效价检测 | 第48-49页 |
| 3.3 讨论 | 第49-50页 |
| 3.3.1 CDV H基因片段的选择 | 第49页 |
| 3.3.2 重组表达系统选择 | 第49-50页 |
| 3.3.3 包涵体及复性 | 第50页 |
| 3.4 小结 | 第50-51页 |
| 第四章 犬瘟热间接ELISA方法的初步建立 | 第51-58页 |
| 4.1 材料与方法 | 第51-53页 |
| 4.1.1 试验设备与试剂 | 第51页 |
| 4.1.2 相关试剂配制 | 第51-52页 |
| 4.1.3 试验方法 | 第52-53页 |
| 4.1.3.1 间接ELISA操作步骤 | 第52页 |
| 4.1.3.2 间接ELISA相关试验条件确定 | 第52页 |
| 4.1.3.3 间接ELISA阴、阳性血清临界值确定试验 | 第52-53页 |
| 4.1.3.4 重复性试验 | 第53页 |
| 4.1.3.5 特异性试验 | 第53页 |
| 4.1.3.6 犬血样检测 | 第53页 |
| 4.2 结果 | 第53-57页 |
| 4.2.1 抗原包被浓度和犬血清稀释倍数优化方阵滴度结果 | 第53页 |
| 4.2.2 二抗稀释倍数优化试验结果 | 第53-54页 |
| 4.2.3 最佳封闭液确定 | 第54-55页 |
| 4.2.4 显色时间的确定 | 第55页 |
| 4.2.5 间接ELISA阴阳性判定临界值计算 | 第55-56页 |
| 4.2.6 重复性试验 | 第56页 |
| 4.2.7 特异性试验结果 | 第56页 |
| 4.2.8 样品检测结果 | 第56-57页 |
| 4.3 讨论 | 第57-58页 |
| 全文总结 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 作者简介 | 第67页 |
