| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第9-19页 |
| 1.1 生物催化在医药中间体生产中的应用 | 第9-11页 |
| 1.1.1 生物催化概况 | 第9页 |
| 1.1.2 生物催化在医药中间体生产中的应用 | 第9-11页 |
| 1.2 蛋白质工程改造技术最新进展 | 第11-14页 |
| 1.2.1 传统定向进化策略 | 第11-12页 |
| 1.2.2 基于序列结构分析的半理性改造策略 | 第12-13页 |
| 1.2.3 基于计算机模拟的理性改造策略 | 第13-14页 |
| 1.3 构象动力学工程简介及其应用 | 第14-16页 |
| 1.3.1 构象动力学工程简介 | 第14页 |
| 1.3.2 构象动力学工程在提高酶的对映体选择性的应用 | 第14-15页 |
| 1.3.3 构象动力学工程在降低酶的产物抑制的应用 | 第15-16页 |
| 1.4 本论文的立题依据和主要研究内容 | 第16-19页 |
| 第二章 材料与方法 | 第19-27页 |
| 2.1 试验材料 | 第19-20页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第19页 |
| 2.1.2 培养基 | 第19页 |
| 2.1.3 试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.4 仪器 | 第20页 |
| 2.2 突变体的设计与构建 | 第20-23页 |
| 2.2.1 DNA基本操作 | 第20页 |
| 2.2.2 分子动力学模拟 | 第20-21页 |
| 2.2.3 CALB突变体的构建与筛选 | 第21页 |
| 2.2.4 L-氨基酸脱氨酶突变体的构建与筛选 | 第21-23页 |
| 2.3 酶的生产与转化能力评价 | 第23-24页 |
| 2.3.1 含CALB突变体的毕赤酵母GS115产酶条件优化 | 第23页 |
| 2.3.2 含L-氨基酸脱氨酶突变体的大肠杆菌产酶条件优化 | 第23页 |
| 2.3.3 CALB催化生产(R)-3-TBDMSO戊二酸单甲酯的条件优化 | 第23-24页 |
| 2.3.4 L-氨基酸脱氨酶催化生产苯丙酮酸的条件优化 | 第24页 |
| 2.4 分析测定方法 | 第24-27页 |
| 2.4.1 毕赤酵母GS115与大肠杆菌细胞浓度测定 | 第24页 |
| 2.4.2 CALB和L-氨基酸脱氨酶的酶活力测定 | 第24-25页 |
| 2.4.3 (R)-3-TBDMSO戊二酸单甲酯和苯丙酮酸的测定方法 | 第25-27页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第27-51页 |
| 3.1 构象动力学工程方法的建立 | 第27-29页 |
| 3.1.1 构象动力学工程 | 第27页 |
| 3.1.2 构象动力学工程方法流程的建立 | 第27-28页 |
| 3.1.3 构象动力学工程方法模拟平台的搭建 | 第28-29页 |
| 3.1.4 小结 | 第29页 |
| 3.2 构象动力学工程提高CALB的对映体选择性 | 第29-40页 |
| 3.2.1 温度对EF5对映体选择性的影响 | 第30页 |
| 3.2.2 构象动力学工程设计突变体 | 第30-33页 |
| 3.2.3 突变体的计算模拟评价 | 第33-35页 |
| 3.2.4 突变体的实验参数评价 | 第35-36页 |
| 3.2.5 CALB突变体催化制备(R)-3-TBDMSO戊二酸单甲酯体系优化 | 第36-38页 |
| 3.2.6 (R)-3-TBDMSO戊二酸单甲酯的规模化制备 | 第38-39页 |
| 3.2.7 小结 | 第39-40页 |
| 3.3 构象动力学工程降低L-氨基酸脱氨酶的产物抑制 | 第40-51页 |
| 3.3.1 产物抑制对L-氨基酸脱氨酶合成苯丙酮酸的影响 | 第40-41页 |
| 3.3.2 构象动力学工程确定突变位点 | 第41页 |
| 3.3.3 单点突变体的构建与筛选 | 第41-42页 |
| 3.3.4 组合突变体的设计、构建与筛选 | 第42-43页 |
| 3.3.5 突变体的评价 | 第43-44页 |
| 3.3.6 L-氨基酸脱氨酶突变体催化制备苯丙酮酸的体系优化 | 第44-48页 |
| 3.3.7 苯丙氨酸的规模化制备 | 第48页 |
| 3.3.8 小结 | 第48-51页 |
| 主要结论与展望 | 第51-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第58页 |
