| 缩略词表 | 第7-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 前言 | 第13-19页 |
| 第一部分 ：促胚胎干细胞分化microRNA的筛选研究 | 第19-58页 |
| 实验材料 | 第19-27页 |
| 1 细胞株 | 第19页 |
| 1.1 小鼠胚胎干细胞 | 第19页 |
| 2 试剂及抗体 | 第19-20页 |
| 2.1 细胞培养试剂 | 第19-20页 |
| 2.2 生化试剂 | 第20页 |
| 2.3 抗体 | 第20页 |
| 3 工具酶及分子量Marker | 第20页 |
| 4 试剂盒 | 第20页 |
| 5 核酸合成 | 第20-22页 |
| 5.1 引物合成 | 第20-22页 |
| 5.2 mimics、inhibitors及siRNA合成 | 第22页 |
| 6 生物信息学分析软件 | 第22页 |
| 7 主要耗材 | 第22-23页 |
| 8 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 9 主要试剂的配制 | 第24-27页 |
| 9.1 细胞培养基配制 | 第24-25页 |
| 9.2 细胞培养用溶液配制 | 第25-27页 |
| 实验方法 | 第27-35页 |
| 1 细胞培养 | 第27-29页 |
| 1.1 小鼠胚胎干细胞的培养 | 第27-28页 |
| 1.2 细胞转染实验 | 第28-29页 |
| 2 胚胎干细胞特征检测 | 第29-32页 |
| 2.1 碱性磷酸酶染色 | 第29页 |
| 2.2 免疫荧光 | 第29-30页 |
| 2.3 实时荧光定量PCR | 第30-31页 |
| 2.4 流式细胞术检测细胞周期 | 第31-32页 |
| 2.5 流式细胞术检测ES细胞OCT4或SSEA1的表达 | 第32页 |
| 3 胚胎干细胞分化能力检测 | 第32-35页 |
| 3.1 拟胚体(Embryoid body,EB)形成实验 | 第32-33页 |
| 3.2 ES细胞向神经元细胞方向分化 | 第33-34页 |
| 3.3 ES细胞向心肌细胞方向分化 | 第34-35页 |
| 实验结果 | 第35-54页 |
| 1. ES细胞的培养及分化 | 第35-37页 |
| 1.1 V6.5和ES1细胞特征鉴定 | 第35-37页 |
| 2. 促ES细胞分化的候选microRNA的筛选 | 第37-54页 |
| 2.1 MicroRNA表达谱分析 | 第38-42页 |
| 2.2 microRNA靶基因预测 | 第42-43页 |
| 2.3 确定功能筛选候选microRNA | 第43-44页 |
| 2.4 候选microRNA的功能验证 | 第44-51页 |
| 2.5 筛选结果排序 | 第51-52页 |
| 2.6 流式检测Oct4表达情况 | 第52页 |
| 2.7 促ES细胞分化的microRNA在野生型细胞中的功能验证 | 第52-54页 |
| 讨论 | 第54-58页 |
| 1 microRNA功能筛选结果分析 | 第54-56页 |
| 1.1 促ES细胞分化microRNAs | 第55页 |
| 1.2 促ES细胞自我更新的microRNAs | 第55-56页 |
| 2 与类似研究的对比和分析 | 第56-58页 |
| 第二部分 ：miR-23a～27a～24基因簇功能和机制研究 | 第58-119页 |
| 实验材料 | 第58-71页 |
| 1 菌株与质粒 | 第58页 |
| 1.1 菌株 | 第58页 |
| 1.2 质粒 | 第58页 |
| 2 细胞株 | 第58-59页 |
| 2.1 小鼠胚胎干细胞 | 第58页 |
| 2.2 饲养层细胞 | 第58-59页 |
| 2.3 其余细胞系 | 第59页 |
| 3 试剂及抗体 | 第59-61页 |
| 3.1 细胞培养试剂 | 第59-60页 |
| 3.2 生化试剂 | 第60页 |
| 3.3 抗体 | 第60-61页 |
| 4 工具酶及分子量Marker | 第61页 |
| 5 试剂盒 | 第61-62页 |
| 6 核酸合成 | 第62-65页 |
| 6.1 引物合成 | 第62-65页 |
| 6.2 mimics、inhibitors及siRNA合成 | 第65页 |
| 7 免疫缺陷小鼠 | 第65页 |
| 8 生物信息学分析软件 | 第65-66页 |
| 9 主要耗材 | 第66页 |
| 10 主要仪器设备 | 第66页 |
| 11 主要试剂的配制 | 第66-71页 |
| 11.1 抗生素溶液 | 第66页 |
| 11.2 细菌培养基的配制 | 第66-67页 |
| 11.3 细胞培养基配制 | 第67页 |
| 11.4 Western blot常用溶液配制 | 第67-69页 |
| 11.5 常用试剂的配制 | 第69-71页 |
| 实验方法 | 第71-97页 |
| 1 载体的制备 | 第71-74页 |
| 1.1 感受态细胞的制备 | 第71页 |
| 1.2 质粒的快速热激活转化 | 第71页 |
| 1.3 质粒的小量提取(QIAGEN质粒小提试剂盒) | 第71-72页 |
| 1.4 质粒的中量或大量提取(QIAGEN质粒中提或大提试剂盒) | 第72-73页 |
| 1.5 质粒的鉴定 | 第73-74页 |
| 2 细胞培养 | 第74-79页 |
| 2.1 饲养层细胞的制备 | 第74-75页 |
| 2.2 小鼠胚胎干细胞的培养 | 第75-76页 |
| 2.3 Plat-E细胞系复苏、培养及冻存 | 第76-77页 |
| 2.4 NIH-3T3或HEK-293T细胞系复苏、培养及冻存 | 第77页 |
| 2.5 细胞转染实验 | 第77-78页 |
| 2.6 逆转录病毒包装及感染 | 第78-79页 |
| 2.7 小鼠成纤维细胞的重编程 | 第79页 |
| 3 胚胎干细胞或诱导多能干细胞的特征检测 | 第79-84页 |
| 3.1 碱性磷酸酶染色 | 第79页 |
| 3.2 免疫荧光 | 第79-80页 |
| 3.3 实时荧光定量PCR | 第80页 |
| 3.4 免疫印记(Western Blot) | 第80-81页 |
| 3.5 流式细胞术检测细胞周期 | 第81页 |
| 3.6 启动子甲基化水平检测 | 第81-83页 |
| 3.7 iPS细胞内外源基因的检测 | 第83-84页 |
| 4 胚胎干细胞分化能力检测 | 第84-86页 |
| 4.1 维甲酸(retinoic acid,RA)诱导分化 | 第84页 |
| 4.2 拟胚体(Embryoid body,EB)形成实验 | 第84页 |
| 4.3 畸胎瘤形成实验 | 第84-86页 |
| 5 microRNA相关实验 | 第86-97页 |
| 5.1 TaqMan stem-loop RT-PCR检测microRNAs的表达 | 第86-87页 |
| 5.2 miRNA的PAGE及Northern杂交 | 第87-88页 |
| 5.3 靶基因3'UTR荧光报告载体的构建 | 第88-89页 |
| 5.4 含有miR-23a-27a-24-2启动子的荧光报告载体的构建 | 第89页 |
| 5.5 双荧光报告实验 | 第89页 |
| 5.6 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP) | 第89-94页 |
| 5.7 RNA-ChIP | 第94-97页 |
| 实验结果 | 第97-115页 |
| 1 miR-23a～27a～24-2功能研究 | 第97-103页 |
| 1.1 miR-23a～27a～24-2结构和表达谱分析 | 第97-99页 |
| 1.2 miR-24,miR-27a抑制胚胎干细胞的自我更新 | 第99-102页 |
| 1.3 miR-24,miR-27a促进ES细胞的分化 | 第102-103页 |
| 2 miR-27a,miR-24作用机制研究 | 第103-109页 |
| 2.1 miR-27a,miR-24-2的靶基因预测及验证 | 第103-106页 |
| 2.2 miR-27a,miR-24-2的上游调控研究 | 第106-108页 |
| 2.3 c-myc和miR-27a,miR-24-2靶基因的关系 | 第108-109页 |
| 3 抑制成体细胞中miR-27a和miR-24的表达能提高重编程效率 | 第109-115页 |
| 3.1 重编程过程中抑制miR-27a和miR-24的表达能提高iPSCs的形成效率 | 第110-111页 |
| 3.2 iPSCs自我更新和分化能力鉴定 | 第111-115页 |
| 讨论 | 第115-119页 |
| 1 miR-23a～27a～24-2功能和作用机制 | 第115-116页 |
| 2 microRNA对于ES细胞自我更新和分化调节的作用机理 | 第116-117页 |
| 3 miR-27a和miR-24促分化功能探讨 | 第117-119页 |
| 总结 | 第119-120页 |
| 参考文献 | 第120-130页 |
| 文献综述 | 第130-141页 |
| 参考文献 | 第134-141页 |
| 致谢 | 第141-142页 |
