| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 1 绪论 | 第17-33页 |
| 1.1 蜜蜂胚胎发育 | 第17-21页 |
| 1.1.1 蜜蜂卵的形态 | 第17页 |
| 1.1.2 蜜蜂的胚胎发育过程 | 第17-20页 |
| 1.1.2.1 卵裂和胚盘的形成 | 第17-18页 |
| 1.1.2.2 胚带、胚层及胚膜的形成 | 第18页 |
| 1.1.2.3 胚胎的分节与附肢的形成 | 第18-19页 |
| 1.1.2.4 器官系统的形成 | 第19-20页 |
| 1.1.2.5 背合 | 第20页 |
| 1.1.3 影响蜜蜂胚胎发育的温湿度 | 第20-21页 |
| 1.2 显微注射技术 | 第21-23页 |
| 1.2.1 动物显微注射技术的发展应用 | 第21-22页 |
| 1.2.2 蜜蜂显微注射技术的研究现状 | 第22-23页 |
| 1.3 基因组定点编辑技术 | 第23-29页 |
| 1.3.1 类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术 | 第24-27页 |
| 1.3.1.1 TALEN的设计原理 | 第24-25页 |
| 1.3.1.2 TALEN作用靶位点的选择 | 第25-26页 |
| 1.3.1.3 TALE的单元组装合成方法 | 第26页 |
| 1.3.1.4 TALEN技术的应用 | 第26-27页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术 | 第27-29页 |
| 1.3.2.1 CRISPR/Cas系统的结构及原理 | 第27-28页 |
| 1.3.2.2 CRISPR/Cas9基因打靶系统的建立及位点结构 | 第28-29页 |
| 1.3.2.3 CRISPR/Cas技术的应用 | 第29页 |
| 1.4 蜜蜂几个发育基因的研究 | 第29-32页 |
| 1.4.1 Dfd基因 | 第29页 |
| 1.4.2 Eve基因 | 第29-30页 |
| 1.4.3 Prd基因 | 第30-31页 |
| 1.4.4 Tll基因 | 第31页 |
| 1.4.5 Otd-1基因 | 第31-32页 |
| 1.4.6 En基因 | 第32页 |
| 1.5 蜜蜂基因组提取方法的研究现状 | 第32-33页 |
| 2 实验材料与方法 | 第33-54页 |
| 2.1 意大利蜜蜂早龄胚胎(蜂卵)的移取和长距离输送器皿的制作 | 第33-34页 |
| 2.1.1 主要试剂及材料 | 第33页 |
| 2.1.2 蜂卵长距离输送器皿的制作 | 第33页 |
| 2.1.3 蜂卵的移取及培养 | 第33-34页 |
| 2.2 蜜蜂早龄胚胎显微注射 | 第34-36页 |
| 2.2.1 主要试剂及材料 | 第34页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第34页 |
| 2.2.3 几种候选注射器皿的制作 | 第34-35页 |
| 2.2.3.1 琼脂糖显微注射皿的制作 | 第34页 |
| 2.2.3.2 蓝丁胶显微注射皿的制作 | 第34页 |
| 2.2.3.3 巢础显微注射皿的制作 | 第34页 |
| 2.2.3.4 双面胶显微注射皿的制作 | 第34-35页 |
| 2.2.4 注射针的制备 | 第35页 |
| 2.2.5 注射前准备 | 第35页 |
| 2.2.6 显微注射技术参数的探索 | 第35-36页 |
| 2.2.7 样品注射 | 第36页 |
| 2.2.7.1 石蜡油油滴样品注射 | 第36页 |
| 2.2.7.2 pEGFP-N1质粒样品注射 | 第36页 |
| 2.3 蜜蜂基因组的快速提取 | 第36-39页 |
| 2.3.1 主要试剂及其实验材料 | 第36页 |
| 2.3.1.1 主要试剂 | 第36页 |
| 2.3.1.2 实验材料 | 第36页 |
| 2.3.2 主要仪器 | 第36-37页 |
| 2.3.3 蜜蜂基因组DNA的提取 | 第37页 |
| 2.3.4 蜜蜂基因组DNA的质量鉴定 | 第37-39页 |
| 2.3.4.1 特异性引物序列设计 | 第37页 |
| 2.3.4.2 PCR扩增 | 第37-38页 |
| 2.3.4.3 1%琼脂糖凝胶电泳 | 第38页 |
| 2.3.4.4 限制性内切酶酶切位点的确定 | 第38页 |
| 2.3.4.5 限制性内切酶的酶切反应 | 第38-39页 |
| 2.3.4.6 2%琼脂糖凝胶电泳 | 第39页 |
| 2.4 TALEN靶向基因敲除技术 | 第39-46页 |
| 2.4.1 主要实验材料与试剂 | 第39页 |
| 2.4.2 主要仪器 | 第39页 |
| 2.4.3 TALEN合成 | 第39-46页 |
| 2.4.3.1 TALEN位点的设计 | 第39-40页 |
| 2.4.3.2 靶位点序列的确定 | 第40-41页 |
| 2.4.3.3 TALE载体的合成 | 第41-44页 |
| 2.4.3.4 构建TALEN | 第44-46页 |
| 2.4.3.5 合成TALEN mRNA | 第46页 |
| 2.4.4 TALEN mRNA的注射 | 第46页 |
| 2.5 CRISPR-Cas9靶向基因敲除技术 | 第46-50页 |
| 2.5.1 主要试剂及材料 | 第46-47页 |
| 2.5.2 主要仪器 | 第47页 |
| 2.5.3 Cas9/gRNA合成 | 第47-50页 |
| 2.5.3.1 Cas9靶位点的设计 | 第47-48页 |
| 2.5.3.2 靶位点序列的确定 | 第48页 |
| 2.5.3.3 Cas9/gRNA体外转录模板的制备 | 第48-49页 |
| 2.5.3.4 Cas9/gRNA体外转录 | 第49-50页 |
| 2.5.3.5 乙醇沉淀法回收Cas9/gRNA | 第50页 |
| 2.5.4 Cas9/gRNA的注射 | 第50页 |
| 2.6 TALEN及Cas9诱导突变的鉴定 | 第50-53页 |
| 2.6.1 PCR扩增 | 第50页 |
| 2.6.2 限制性内切酶酶切鉴定 | 第50-51页 |
| 2.6.3 TA克隆 | 第51-52页 |
| 2.6.4 转化 | 第52页 |
| 2.6.5 菌落PCR | 第52页 |
| 2.6.6 测序比对 | 第52-53页 |
| 2.7 胚胎图像的获取及处理 | 第53-54页 |
| 2.7.1 意大利蜜蜂胚胎显微注射及发育图像的获取 | 第53页 |
| 2.7.2 绿色荧光图像的获取 | 第53-54页 |
| 3 实验结果与分析 | 第54-87页 |
| 3.1 蜜蜂早龄胚胎长距离运输器皿的选择 | 第54-56页 |
| 3.2 蜜蜂早龄胚胎显微注射参数探索 | 第56-67页 |
| 3.2.1 适宜注射器皿的选取 | 第57-59页 |
| 3.2.2 注射部位的选取 | 第59-60页 |
| 3.2.3 注射深度的选取 | 第60-61页 |
| 3.2.4 注射方向的选取 | 第61-62页 |
| 3.2.5 注射量的选取 | 第62-63页 |
| 3.2.6 显微注射对蜂卵发育为幼虫时间的影响 | 第63-64页 |
| 3.2.7 蜜蜂早龄胚胎注射石蜡油样品 | 第64-66页 |
| 3.2.8 蜜蜂早龄胚胎注射pEGFP-N1质粒 | 第66-67页 |
| 3.3 快速提取蜜蜂基因组 | 第67-68页 |
| 3.3.1 PCR扩增 | 第67页 |
| 3.3.2 限制性内切酶酶切 | 第67-68页 |
| 3.4 利用TALEN技术进行基因打靶 | 第68-78页 |
| 3.4.1 确定En、Prd、Tll基因的靶位点序列 | 第68-72页 |
| 3.4.1.1 En基因 | 第68-70页 |
| 3.4.1.2 Prd基因 | 第70-71页 |
| 3.4.1.3 Tll基因 | 第71-72页 |
| 3.4.2 T-基因的左、右臂合成(以T-En基因为例) | 第72-74页 |
| 3.4.3 TALEN-基因mRNA的合成 | 第74-75页 |
| 3.4.4 Tll基因TALEN靶位点的突变诱导 | 第75-78页 |
| 3.4.4.1 蜂卵的显微注射与培养 | 第75页 |
| 3.4.4.2 限制性内切酶酶切检测 | 第75-76页 |
| 3.4.4.3 突变Tll基因TA克隆 | 第76-77页 |
| 3.4.4.4 Tll基因突变产物测序 | 第77-78页 |
| 3.5 利用CRISPR/Cas9技术进行基因打靶 | 第78-87页 |
| 3.5.1 确定基因的靶位点序列 | 第78-83页 |
| 3.5.1.1 Dfd基因 | 第78-79页 |
| 3.5.1.2 Eve基因 | 第79-80页 |
| 3.5.1.3 Otd-1基因 | 第80-81页 |
| 3.5.1.4 Prd基因 | 第81-82页 |
| 3.5.1.5 Tll基因 | 第82-83页 |
| 3.5.2 靶标基因Cas9/gRNA的合成 | 第83-84页 |
| 3.5.3 Otd-1基因的Cas9靶位点突变诱导 | 第84-87页 |
| 3.5.3.1 蜂卵的显微注射与培养 | 第84页 |
| 3.5.3.2 突变的检测 | 第84-85页 |
| 3.5.3.3 突变基因的TA克隆 | 第85-86页 |
| 3.5.3.4 Otd-1基因突变产物测序 | 第86-87页 |
| 4 结果讨论与展望 | 第87-93页 |
| 4.1 蜂卵的移取方法 | 第87页 |
| 4.2 蜂卵的实验室内饲养条件 | 第87-88页 |
| 4.3 蜂卵的显微注射操作 | 第88-89页 |
| 4.3.1 蜂卵显微注射条件探索 | 第88-89页 |
| 4.3.2 在蜂卵中注射石蜡油和pEGFP-N1 | 第89页 |
| 4.4 快速提取蜜蜂基因组 | 第89-90页 |
| 4.5 利用TALEN及CRISPR/Cas9技术进行基因打靶 | 第90-92页 |
| 4.5.1 技术方法 | 第90-91页 |
| 4.5.2 突变诱导 | 第91页 |
| 4.5.3 检测方法 | 第91-92页 |
| 4.6 展望 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 已发表和待发表论文 | 第103页 |
