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机械拉伸对成骨细胞基因表达及可变剪接的研究

摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
主要缩略词第10-12页
1 绪论第12-20页
    1.1 问题的提出和意义第12-14页
    1.2 国内外研究现状第14-18页
        1.2.1 细胞力学加载方式第14-15页
        1.2.2 可变剪接第15-16页
        1.2.3 应力刺激对可变剪接的调控第16-18页
    1.3 本研究的目的内容第18-20页
        1.3.1 研究目的第18页
        1.3.2 研究内容第18页
        1.3.3 研究技术路线第18-20页
2 细胞的培养和观察第20-26页
    2.1 引言第20页
    2.2 细胞培养材料和设备第20-21页
        2.2.1 细胞株第20页
        2.2.2 细胞培养仪器与材料第20-21页
        2.2.3 细胞培养试剂第21页
    2.3 细胞培养准备工作第21-22页
        2.3.1 培养用品的清洗灭菌第21-22页
        2.3.2 培养用液的配制和灭菌第22页
    2.4 细胞培养方法第22-23页
        2.4.1 细胞复苏第22页
        2.4.2 细胞换液第22-23页
        2.4.3 细胞传代第23页
        2.4.4 细胞冻存第23页
    2.5 细胞形态观察第23-24页
    2.6 本章小结第24-26页
3 应力拉伸装置的设计和使用第26-30页
    3.1 引言第26-27页
    3.2 应力拉伸装置的结构和原理第27-28页
    3.3 实验方法第28-29页
        3.3.1 主要材料和仪器第28页
        3.3.2 医用硅橡胶膜的处理第28-29页
        3.3.3 细胞接种第29页
        3.3.4 拉伸参数选择第29页
    3.4 本章小结第29-30页
4 拉伸刺激对 VEGF, CD44 和 cyclinD1 基因表达的影响第30-50页
    4.1 引言第30-32页
    4.2 实验材料第32-34页
        4.2.1 实验细胞第32页
        4.2.2 实验装置和仪器第32-33页
        4.2.3 实验材料和试剂第33-34页
    4.3 实验方法第34-43页
        4.3.1 细胞应力加载第34页
        4.3.2 总 RNA 提取与检测第34-35页
        4.3.3 RNA 反转录成 cDNA第35-36页
        4.3.4 RT-PCR 检测基因表达第36-38页
        4.3.5 q-PCR 检测基因表达第38-39页
        4.3.6 总蛋白提取第39-40页
        4.3.7 蛋白含量测定第40-41页
        4.3.8 Western blot 检测蛋白表达第41-43页
    4.4 实验结果第43-48页
        4.4.1 RT-PCR 条件的优化第43-44页
        4.4.2 VEGF 及其剪接变异体的表达第44-45页
        4.4.3 CD44 及其剪接变异体的表达第45-46页
        4.4.4 cyclinD1 及其剪接变异体的表达第46-48页
    4.5 讨论第48-49页
    4.6 本章小结第49-50页
5 剪接因子 ASF/SF2, SC35 和 hnRNPA1 过表达载体的构建第50-64页
    5.1 引言第50-51页
    5.2 实验材料和仪器第51-52页
        5.2.1 主要仪器和设备第51页
        5.2.2 主要试剂第51-52页
    5.3 实验准备工作第52页
        5.3.1 实验用品的清洗和灭菌第52页
        5.3.2 实验用液的配制和灭菌第52页
    5.4 实验方法第52-58页
        5.4.1 PCR 扩增目的片段第52-54页
        5.4.2 感受态制备第54-55页
        5.4.3 质粒重建第55-56页
        5.4.4 重建质粒扩大培养第56-57页
        5.4.5 测序第57-58页
        5.4.6 质粒提取第58页
    5.5 实验结果第58-61页
        5.5.1 重组质粒 pcDNA3.1(+)-EGFP- ASF/SF2 的构建第58-59页
        5.5.2 重组质粒 pcDNA3.1(+)-EGFP- SC35 的构建第59-60页
        5.5.3 重组质粒 pcDNA3.1(+)-EGFP- hnRNPA1 的构建第60-61页
    5.6 讨论第61-62页
    5.7 本章小结第62-64页
6 剪接因子 ASF/SF2, SC35 和 hnRNPA1 对 VEGF 基因可变剪接的影响第64-72页
    6.1 引言第64页
    6.2 实验材料和仪器第64-66页
        6.2.1 实验细胞第64-65页
        6.2.2 实验装置和仪器第65页
        6.2.3 实验材料和试剂第65-66页
    6.3 实验方法第66-67页
        6.3.1 过表达质粒转染细胞第66页
        6.3.2 总蛋白提取第66页
        6.3.3 蛋白含量测定第66-67页
        6.3.4 western blot 检测蛋白表达第67页
    6.4 实验结果第67-70页
        6.4.1 HaCaT 拉伸加载预实验第67-68页
        6.4.2 重组质粒转染效率鉴定第68页
        6.4.3 重组质粒表达鉴定第68-69页
        6.4.4 VEGF 表达鉴定第69-70页
    6.5 讨论第70-71页
    6.6 本章小结第71-72页
7 结论与展望第72-74页
    7.1 本研究主要结论第72页
    7.2 后续工作展望第72-74页
致谢第74-76页
参考文献第76-82页
附录第82页
    A 作者在攻读学位期间发表的论文第82页
    B 作者在攻读学位期间参加的科研项目第82页

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