| 摘要 | 第3-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 主要缩略词 | 第10-12页 |
| 1 绪论 | 第12-20页 |
| 1.1 问题的提出和意义 | 第12-14页 |
| 1.2 国内外研究现状 | 第14-18页 |
| 1.2.1 细胞力学加载方式 | 第14-15页 |
| 1.2.2 可变剪接 | 第15-16页 |
| 1.2.3 应力刺激对可变剪接的调控 | 第16-18页 |
| 1.3 本研究的目的内容 | 第18-20页 |
| 1.3.1 研究目的 | 第18页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第18页 |
| 1.3.3 研究技术路线 | 第18-20页 |
| 2 细胞的培养和观察 | 第20-26页 |
| 2.1 引言 | 第20页 |
| 2.2 细胞培养材料和设备 | 第20-21页 |
| 2.2.1 细胞株 | 第20页 |
| 2.2.2 细胞培养仪器与材料 | 第20-21页 |
| 2.2.3 细胞培养试剂 | 第21页 |
| 2.3 细胞培养准备工作 | 第21-22页 |
| 2.3.1 培养用品的清洗灭菌 | 第21-22页 |
| 2.3.2 培养用液的配制和灭菌 | 第22页 |
| 2.4 细胞培养方法 | 第22-23页 |
| 2.4.1 细胞复苏 | 第22页 |
| 2.4.2 细胞换液 | 第22-23页 |
| 2.4.3 细胞传代 | 第23页 |
| 2.4.4 细胞冻存 | 第23页 |
| 2.5 细胞形态观察 | 第23-24页 |
| 2.6 本章小结 | 第24-26页 |
| 3 应力拉伸装置的设计和使用 | 第26-30页 |
| 3.1 引言 | 第26-27页 |
| 3.2 应力拉伸装置的结构和原理 | 第27-28页 |
| 3.3 实验方法 | 第28-29页 |
| 3.3.1 主要材料和仪器 | 第28页 |
| 3.3.2 医用硅橡胶膜的处理 | 第28-29页 |
| 3.3.3 细胞接种 | 第29页 |
| 3.3.4 拉伸参数选择 | 第29页 |
| 3.4 本章小结 | 第29-30页 |
| 4 拉伸刺激对 VEGF, CD44 和 cyclinD1 基因表达的影响 | 第30-50页 |
| 4.1 引言 | 第30-32页 |
| 4.2 实验材料 | 第32-34页 |
| 4.2.1 实验细胞 | 第32页 |
| 4.2.2 实验装置和仪器 | 第32-33页 |
| 4.2.3 实验材料和试剂 | 第33-34页 |
| 4.3 实验方法 | 第34-43页 |
| 4.3.1 细胞应力加载 | 第34页 |
| 4.3.2 总 RNA 提取与检测 | 第34-35页 |
| 4.3.3 RNA 反转录成 cDNA | 第35-36页 |
| 4.3.4 RT-PCR 检测基因表达 | 第36-38页 |
| 4.3.5 q-PCR 检测基因表达 | 第38-39页 |
| 4.3.6 总蛋白提取 | 第39-40页 |
| 4.3.7 蛋白含量测定 | 第40-41页 |
| 4.3.8 Western blot 检测蛋白表达 | 第41-43页 |
| 4.4 实验结果 | 第43-48页 |
| 4.4.1 RT-PCR 条件的优化 | 第43-44页 |
| 4.4.2 VEGF 及其剪接变异体的表达 | 第44-45页 |
| 4.4.3 CD44 及其剪接变异体的表达 | 第45-46页 |
| 4.4.4 cyclinD1 及其剪接变异体的表达 | 第46-48页 |
| 4.5 讨论 | 第48-49页 |
| 4.6 本章小结 | 第49-50页 |
| 5 剪接因子 ASF/SF2, SC35 和 hnRNPA1 过表达载体的构建 | 第50-64页 |
| 5.1 引言 | 第50-51页 |
| 5.2 实验材料和仪器 | 第51-52页 |
| 5.2.1 主要仪器和设备 | 第51页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第51-52页 |
| 5.3 实验准备工作 | 第52页 |
| 5.3.1 实验用品的清洗和灭菌 | 第52页 |
| 5.3.2 实验用液的配制和灭菌 | 第52页 |
| 5.4 实验方法 | 第52-58页 |
| 5.4.1 PCR 扩增目的片段 | 第52-54页 |
| 5.4.2 感受态制备 | 第54-55页 |
| 5.4.3 质粒重建 | 第55-56页 |
| 5.4.4 重建质粒扩大培养 | 第56-57页 |
| 5.4.5 测序 | 第57-58页 |
| 5.4.6 质粒提取 | 第58页 |
| 5.5 实验结果 | 第58-61页 |
| 5.5.1 重组质粒 pcDNA3.1（+）-EGFP- ASF/SF2 的构建 | 第58-59页 |
| 5.5.2 重组质粒 pcDNA3.1（+）-EGFP- SC35 的构建 | 第59-60页 |
| 5.5.3 重组质粒 pcDNA3.1（+）-EGFP- hnRNPA1 的构建 | 第60-61页 |
| 5.6 讨论 | 第61-62页 |
| 5.7 本章小结 | 第62-64页 |
| 6 剪接因子 ASF/SF2, SC35 和 hnRNPA1 对 VEGF 基因可变剪接的影响 | 第64-72页 |
| 6.1 引言 | 第64页 |
| 6.2 实验材料和仪器 | 第64-66页 |
| 6.2.1 实验细胞 | 第64-65页 |
| 6.2.2 实验装置和仪器 | 第65页 |
| 6.2.3 实验材料和试剂 | 第65-66页 |
| 6.3 实验方法 | 第66-67页 |
| 6.3.1 过表达质粒转染细胞 | 第66页 |
| 6.3.2 总蛋白提取 | 第66页 |
| 6.3.3 蛋白含量测定 | 第66-67页 |
| 6.3.4 western blot 检测蛋白表达 | 第67页 |
| 6.4 实验结果 | 第67-70页 |
| 6.4.1 HaCaT 拉伸加载预实验 | 第67-68页 |
| 6.4.2 重组质粒转染效率鉴定 | 第68页 |
| 6.4.3 重组质粒表达鉴定 | 第68-69页 |
| 6.4.4 VEGF 表达鉴定 | 第69-70页 |
| 6.5 讨论 | 第70-71页 |
| 6.6 本章小结 | 第71-72页 |
| 7 结论与展望 | 第72-74页 |
| 7.1 本研究主要结论 | 第72页 |
| 7.2 后续工作展望 | 第72-74页 |
| 致谢 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-82页 |
| 附录 | 第82页 |
| A 作者在攻读学位期间发表的论文 | 第82页 |
| B 作者在攻读学位期间参加的科研项目 | 第82页 |
