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广谱有机磷农药单克隆抗体、单链抗体的制备及免疫检测技术研究

中文摘要第3-5页
Abstract第5-6页
第一章 综述第13-24页
    1.1 有机磷农药概述第13页
    1.2 有机磷农药残留检测技术概述第13-15页
        1.2.1 仪器分析法第13-14页
        1.2.2 酶抑制法第14页
        1.2.3 生物传感器法第14页
        1.2.4 免疫分析法第14-15页
    1.3 抗体研究的发展历程第15-18页
        1.3.1 多克隆抗体研究第15页
        1.3.2 单克隆抗体第15-16页
        1.3.3 基因工程抗体第16-18页
            1.3.3.1 单链抗体第16-18页
            1.3.3.2 双特异性抗体第18页
    1.4 单克隆抗体的应用第18-20页
        1.4.1 单克隆抗体在医药方面的应用第18-19页
            1.4.1.1 疾病诊断第18-19页
            1.4.1.2 疾病的治疗第19页
            1.4.1.3 单抗-药物偶联物第19页
        1.4.2 单克隆抗体在农业以及食品安全方面的应用第19-20页
    1.5 单链抗体的应用第20-21页
        1.5.1 单链抗体在医学领域的应用第20页
        1.5.2 单链抗体在食品安全领域的应用第20-21页
    1.6 常用的免疫检测技术第21-22页
        1.6.1 Western印迹第21页
        1.6.2 酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay;ELISA)第21-22页
    1.7 选题依据及研究内容第22-24页
第二章 广谱有机磷农药人工抗原的制备第24-32页
    2.1 实验仪器及材料第24-25页
        2.1.1 主要实验仪器第24页
        2.1.2 主要实验材料第24-25页
    2.2 实验方法第25-26页
        2.2.1 半抗原的合成第25页
        2.2.2 人工抗原的合成第25-26页
            2.2.2.1 活泼酯法合成包被抗原第25-26页
            2.2.2.2 混合酸酐法合成免疫原第26页
        2.2.3 人工抗原的鉴定第26页
            2.2.3.1 紫外分光光度法全波长扫描及偶联比测算第26页
    2.3 结果与分析第26-28页
        2.3.1 半抗原的合成与鉴定第26-27页
        2.3.2 人工合成抗原的鉴定第27-28页
    2.4 讨论第28-31页
        2.4.1 半抗原的设计第28页
        2.4.2 半抗原分子的合成方法第28-29页
        2.4.3 载体蛋白的选择第29页
        2.4.4 人工抗原的合成方法第29-30页
        2.4.5 人工抗原的鉴定方法第30-31页
            2.4.5.1 紫外分光光度法第30页
            2.4.5.2 核磁共振法第30页
            2.4.5.3 飞行质谱法第30页
            2.4.5.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳第30-31页
    2.5 本章小结第31-32页
第三章 广谱有机磷农药单克隆抗体的制备及ELISA方法的建立第32-53页
    3.1 实验仪器及材料第32-36页
        3.1.1 主要实验仪器第32-33页
        3.1.2 主要实验药品及材料第33-34页
        3.1.3 主要溶液的配制第34-35页
        3.1.4 实验材料的前处理第35-36页
    3.2 实验方法第36-43页
        3.2.1 免疫实验动物及效果鉴定第36-37页
            3.2.1.1 建立免疫、采血方案第36-37页
            3.2.1.2 小鼠多抗血清效价测定及其对半抗原及不同农药的抑制情况第37页
        3.2.2 细胞融合第37-39页
            3.2.2.1 SP2/0的复苏及培养第37-38页
            3.2.2.2 制备饲养层细胞第38页
            3.2.2.3 融合用脾细胞的制备第38-39页
            3.2.2.4 细胞融合第39页
        3.2.3 融合后细胞的培养第39-40页
        3.2.4 杂交瘤细胞筛选及细胞亚克隆第40页
        3.2.5 体内诱生法制备单克隆抗体第40页
        3.2.6 辛酸-硫酸铵法粗纯化腹水抗体第40页
        3.2.7 ProteinG柱纯化抗体第40-41页
        3.2.8 抗体纯度鉴定第41页
        3.2.9 抗体亚型鉴定第41-42页
        3.2.10 确定抗体检测谱及对有机磷类农药的灵敏度鉴定第42-43页
            3.2.10.1 确定单克隆抗体与包被原的最佳工作浓度第42页
            3.2.10.2 确定单克隆抗体对有机磷农药的检测谱第42页
            3.2.10.3 确定单克隆抗体对半抗原的检测灵敏度第42-43页
    3.3 结果与分析第43-49页
        3.3.1 小鼠免疫效果鉴定第43-44页
        3.3.2 细胞融合及杂交瘤细胞培养第44页
        3.3.3 单克隆抗体纯化效果及抗体亚型鉴定第44-45页
            3.3.3.1 单克隆抗体纯化效果鉴定第44-45页
            3.3.3.2 单克隆抗体亚型鉴定第45页
        3.3.4 确定单克隆抗体与包被原的最佳工作浓度第45页
        3.3.5 确定单克隆抗体对有机磷农药的检测谱第45-48页
        3.3.6 确定单克隆抗体对半抗原的检测灵敏度第48-49页
    3.4 讨论第49-52页
        3.4.1 单克隆抗体制备过程中的一系列问题第49-52页
    3.5 本章小结第52-53页
第四章 抗有机磷农药单链抗体的制备及ELISA方法的建立第53-77页
    4.1 实验仪器及材料第53-55页
        4.1.1 主要实验仪器第53-54页
        4.1.2 主要实验材料第54-55页
        4.1.3 培养基的配制第55页
    4.2 实验方法第55-65页
        4.2.1 所用引物的设计第55页
        4.2.2 提取细胞总RNA第55-56页
        4.2.3 cDNA第一链的合成第56页
        4.2.4 cDNA的鉴定第56-57页
        4.2.5 抗体重、轻链基因的扩增第57页
        4.2.6 重、轻链可变区基因的克隆与鉴定第57-59页
        4.2.7 单链抗体基因的构建第59-61页
            4.2.7.1 SOE-PCR构建单链抗体(scFv)基因第59-61页
        4.2.8 单链抗体基因的克隆与鉴定第61页
        4.2.9 原核表达载体的构建第61-63页
        4.2.10 scFv在E.coliBL21(DE3)内的表达及纯化第63页
            4.2.10.1 最佳诱导温度的优化第63页
            4.2.10.2 最佳诱导浓度的优化第63页
            4.2.10.3 最佳诱导时间的优化第63页
        4.2.11 SDS-PAGE凝胶电泳法分析表达情况第63页
        4.2.12 周质蛋白的提取第63页
        4.2.13 目的蛋白的纯化第63-64页
        4.2.14 纯化后目的蛋白的处理第64页
        4.2.15 Westernblot(WB)分析目的蛋白第64页
        4.2.16 scFv活性鉴定第64-65页
    4.3 结果与分析第65-75页
        4.3.1 cDNA的鉴定第65页
        4.3.2 重、轻链可变区基因的扩增第65-66页
        4.3.3 T-A克隆后阳性菌落的鉴定及测序分析第66-67页
        4.3.4 scFv基因的构建第67-68页
        4.3.5 scFv基因的克隆及序列鉴定第68页
        4.3.6 原核表达体系的构建与表达第68-72页
            4.3.6.1 scFv原核表达载体的构建与鉴定第68-70页
            4.3.6.2 scFv在E.coliBL21(DE3)内的表达及纯化与鉴定第70-72页
        4.3.7 确定单链抗体scFv对有机磷农药的识别谱第72-75页
    4.4 讨论第75页
    4.5 本章小结第75-77页
参考文献第77-83页
在学期间的研究成果第83-84页
致谢第84页

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