| 中文部分 | 第1-135页 |
| 中文摘要 | 第14-22页 |
| 英文摘要 | 第22-31页 |
| 符号说明 | 第31-33页 |
| 前言 | 第33-41页 |
| 总体技术路线 | 第41-42页 |
| 第一部分 影响TRAIL诱导凋亡的HBV基因片段的筛选及其作用研究 | 第42-65页 |
| 第一节 反义封闭HBx、HBpreS2表达的体外抗病毒效应 | 第43-48页 |
| 材料与方法 | 第43-45页 |
| 1.材料 | 第43-44页 |
| 2.方法 | 第44-45页 |
| ·PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2的设计、合成和溶解 | 第44页 |
| ·PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2的体外抗病毒效应 | 第44-45页 |
| 结果 | 第45-46页 |
| 1.PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2对HBV抗原表达的影响 | 第45-46页 |
| 2.PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2对HBV DNA含量的影响 | 第46页 |
| 讨论 | 第46-48页 |
| 第二节 反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响 | 第48-56页 |
| 材料与方法 | 第48-53页 |
| 1.材料 | 第48-50页 |
| 2.方法 | 第50-53页 |
| ·HepG2.2.15细胞对TRAIL敏感性的检测 | 第50-52页 |
| ·反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响 | 第52-53页 |
| 结果 | 第53-54页 |
| 1.HepG2.2.15细胞对TRAIL敏感性的检测 | 第53-54页 |
| ·倒置显微镜下观察形态学变化 | 第53页 |
| ·MTT法检测细胞杀伤率 | 第53页 |
| ·可溶性DR5蛋白阻断TRAIL的细胞毒效应 | 第53-54页 |
| 2.反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响 | 第54页 |
| ·倒置显微镜下观察形态学变化 | 第54页 |
| ·MTT法检测细胞杀伤率 | 第54页 |
| ·TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡 | 第54页 |
| 讨论 | 第54-56页 |
| 第三节 反义封闭HBx、HBpreS2对TRAIL受体表达的影响 | 第56-64页 |
| 材料与方法 | 第56-63页 |
| 1.材料 | 第56-58页 |
| 2.方法 | 第58-63页 |
| ·半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 | 第58-59页 |
| ·Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 | 第59-62页 |
| ·流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 | 第62-63页 |
| 结果 | 第63页 |
| 1.半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 | 第63页 |
| 2.Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 | 第63页 |
| 3.流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 | 第63页 |
| 讨论 | 第63-64页 |
| 小结 | 第64-65页 |
| 第二部分 HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL诱导凋亡的影响及其机制的体外研究 | 第65-123页 |
| 第一节 含HBx、MHBs(t)基因片段真核表达载体的构建及表达 | 第66-82页 |
| 技术路线 | 第66-67页 |
| 材料与方法 | 第67-77页 |
| 1.材料 | 第67-69页 |
| 2.方法 | 第69-77页 |
| ·HBx、MHBs(t)基因片段的PCR扩增、回收及纯化 | 第69-71页 |
| ·目的基因与载体的连接和重组子的转化 | 第71-73页 |
| ·阳性重组子的筛选与鉴定 | 第73-75页 |
| ·HBx、MHBs(t)基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 | 第75-77页 |
| 结果 | 第77-80页 |
| 1.HBx、MHBs(t)基因片段的PCR扩增、回收及纯化 | 第77-78页 |
| ·PCR扩增HBx、MHBs(t)基因片段 | 第77-78页 |
| ·回收、纯化PCR产物 | 第78页 |
| 2.pcDNA-HBx、pcDNA-MHBs(t)真核表达载体的构建及鉴定 | 第78-79页 |
| ·目的基因和载体的酶切回收 | 第78页 |
| ·目的基因与载体的连接、转化 | 第78页 |
| ·阳性重组子的筛选和鉴定 | 第78-79页 |
| 3.HBx、MHBs(t)基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 | 第79-80页 |
| ·试剂盒小量提取质粒 | 第79页 |
| ·肝癌细胞系BEL7402对TRAIL敏感性的检测 | 第79页 |
| ·阳性细胞克隆的筛选 | 第79-80页 |
| ·稳定筛选细胞的鉴定 | 第80页 |
| 讨论 | 第80-82页 |
| 第二节 HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 | 第82-88页 |
| 材料与方法 | 第82-83页 |
| 1.材料 | 第82页 |
| 2.方法 | 第82-83页 |
| ·MTT法检测不同浓度TRAIL对细胞生长的抑制效应 | 第82-83页 |
| ·倒置显微镜下观察形态学变化 | 第83页 |
| ·TUNEL流式细胞术检测TRAIL诱导的凋亡效应 | 第83页 |
| 结果 | 第83-84页 |
| 1.MTT法检测细胞杀伤率 | 第83页 |
| 2.倒置显微镜下形态学观察 | 第83-84页 |
| 3.TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡率 | 第84页 |
| 讨论 | 第84-88页 |
| 第三节 HBx、MHBs(t)的表达促进TRAIL诱导凋亡的机制研究 | 第88-105页 |
| 技术路线 | 第88-89页 |
| 材料与方法 | 第89-95页 |
| 1.材料 | 第89-90页 |
| 2.方法 | 第90-95页 |
| ·胞膜受体水平的检测 | 第90-91页 |
| ·胞浆凋亡通路水平的检测 | 第91-95页 |
| 结果 | 第95-99页 |
| 1.HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL受体水平的影响 | 第95-96页 |
| ·半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 | 第95-96页 |
| ·Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 | 第96页 |
| ·流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 | 第96页 |
| 2.HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL凋亡通路分子表达或活化的影响 | 第96-99页 |
| ·Caspase 3活化水平的检测 | 第96-97页 |
| ·线粒体非依赖途径 | 第97页 |
| ·线粒体依赖途径 | 第97-99页 |
| 讨论 | 第99-105页 |
| 第四节 小干扰RNA封闭Bax的表达对HBx影响TRAIL诱导凋亡的逆转效应 | 第105-122页 |
| 技术路线 | 第105-106页 |
| 材料与方法 | 第106-113页 |
| 1.材料 | 第106-107页 |
| 2.方法 | 第107-113页 |
| ·阳性对照小干扰RNA载体对GAPDH表达的抑制效率 | 第107-111页 |
| ·有效封闭Bax表达的小干扰RNA载体的筛选 | 第111-112页 |
| ·封闭Bax的表达对HBx上调TRAIL诱导凋亡的影响 | 第112-113页 |
| ·封闭Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响 | 第113页 |
| 结果 | 第113-116页 |
| 1.阳性对照小干扰RNA载体有效抑制GAPDH的表达 | 第113-114页 |
| ·成功构建GAPDH小干扰RNA载体和阴性对照载体 | 第113页 |
| ·阳性对照小干扰RNA载体有效抑制GAPDH的表达 | 第113-114页 |
| 2.有效封闭Bax表达的小干扰RNA载体的筛选 | 第114-115页 |
| ·Bax小干扰RNA载体的DNA测序结果及序列分析 | 第114页 |
| ·小干扰RNA载体对Bax表达的抑制效应 | 第114-115页 |
| 3.封闭Bax的表达可逆转HBx对TRAIL诱导凋亡的影响 | 第115页 |
| 4.封闭Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响 | 第115-116页 |
| 讨论 | 第116-122页 |
| 小结 | 第122-123页 |
| 第三部分 HBx的表达影响TRAIL诱导凋亡的体内研究 | 第123-135页 |
| 技术路线 | 第123-124页 |
| 材料与方法 | 第124-130页 |
| 1.材料 | 第124-125页 |
| 2.方法 | 第125-130页 |
| ·试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBx | 第125-126页 |
| ·腺病毒的体外扩增、滴度测定及体外活性检测 | 第126-128页 |
| ·HBx基因及TRAIL腺病毒在小鼠肝组织内的表达 | 第128-129页 |
| ·HBx的表达对TRAIL腺病毒介导的肝脏损伤的影响 | 第129-130页 |
| 结果 | 第130-132页 |
| 1.试剂盒大量提取质粒 | 第130页 |
| 2.TRAIL腺病毒的体外扩增、滴度测定和体外活性检测 | 第130-131页 |
| ·倒置显微镜下观察腺病毒感染后的细胞病变 | 第130-131页 |
| ·空斑形成试验测定病毒滴度 | 第131页 |
| ·TRAIL腺病毒体外活性检测 | 第131页 |
| 3.HBx在小鼠肝组织内的表达 | 第131页 |
| ·半定量RT-PCR检测HBx mRNA水平的表达 | 第131页 |
| ·Western blot检测HBx蛋白质水平的表达 | 第131页 |
| 4.HBx的表达增强TRAIL腺病毒诱导肝细胞凋亡 | 第131-132页 |
| ·小鼠血清谷丙转氨酶水平 | 第131-132页 |
| ·各器官组织病理学改变 | 第132页 |
| ·PI流式细胞术检测肝细胞凋亡 | 第132页 |
| 讨论 | 第132-134页 |
| 小结 | 第134-135页 |
| 英文部分 | 第135-212页 |
| Preface | 第135-143页 |
| Part I Preliminary screening and study of valuable HBV fragments for effects on TRAIL-induced apoptosis | 第143-162页 |
| Section 1 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on HBV antigen synthesis and HBV DNA replication | 第144-149页 |
| Materials and methods | 第144-146页 |
| 1. Materials | 第144-145页 |
| 2. Methods | 第145-146页 |
| ·Design,synthesis and preparation of PS-asODNs/HBx,PS-asODNs/preS2 | 第145页 |
| ·Antiviral effects of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 in vitro | 第145-146页 |
| Results | 第146-149页 |
| 1. Inhibition of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 on the expression of HBsAg, HBeAg | 第146-147页 |
| 2. Inhibition of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 on HBV DNA 134 Discussion | 第147-149页 |
| Section 2 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis | 第149-155页 |
| Materials and methods | 第149-152页 |
| 1. Materials | 第149-150页 |
| 2. Methods | 第150-152页 |
| ·Sensitivity of HepG2.2.15 cells towards TRAIL | 第150-151页 |
| ·Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis | 第151-152页 |
| Results | 第152-153页 |
| 1. Sensitivity of HepG2.2.15 towards TRAIL | 第152-153页 |
| ·Morphological changes | 第152页 |
| ·Results of MTT assay | 第152页 |
| ·Blockade of TRAIL cytotoxicity by sDR5 | 第152-153页 |
| 2. Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis l40 | 第153页 |
| ·Morphological changes | 第153页 |
| ·Cytotoxicity rate detected by MTT assay | 第153页 |
| ·Apoptosis rate detected by TUNEL | 第153页 |
| Discussion | 第153-155页 |
| Section 3 Effects of blocking HBx, HBpreS2 on the level of TRAIL receptors 142 Materials and methods | 第155-162页 |
| Materials and methods | 第155-159页 |
| 1. Materials | 第155-156页 |
| 2. Methods | 第156-159页 |
| ·mRNA expression of TRAIL receptors | 第156-157页 |
| ·Protein expression of TRAIL receptors detected by Western blot | 第157-158页 |
| ·Protein expression of TRAIL receptors detected by FCM | 第158-159页 |
| Results | 第159页 |
| 1. mRNA expression of TRAIL receptors detected by RT-PCR | 第159页 |
| 2. Protein expression of TRAIL receptors detected by Western blot | 第159页 |
| 3. Protein expression of TRAIL receptors detected by FCM | 第159页 |
| Discussion | 第159-160页 |
| Conclusion | 第160-162页 |
| Part II Effects of HBx,MHBs(t) on TRAIL-indcued apoptosis and their molecular mechanisms in vitro | 第162-204页 |
| Section 1 Construction and expression of eukaryotic expression vectors containing HBx or MHBs(t) | 第163-174页 |
| Materials and methods | 第163-170页 |
| 1. Materials | 第163-165页 |
| 2. Methods | 第165-170页 |
| ·Amplification, extraction and purification of HBx and MHBs(t) genes | 第165-166页 |
| ·Ligation and Transformation | 第166-167页 |
| ·Screening and identification of positive recombinants | 第167-168页 |
| ·Establishment and identification of stably-transfected hepatoma cells | 第168-170页 |
| Results | 第170-172页 |
| 1. Amplification, retrieval and purification of HBx, MHBs(t) genes | 第170页 |
| ·PCR amplification of HBx and MHBs(t) genes | 第170页 |
| ·Retrieval and purification of PCR products | 第170页 |
| 2. Construction and identification of pcDNA-HBx and pcDNA-MHBs(t) | 第170-171页 |
| ·Digestion and retrieval of interest genes and vectors | 第170页 |
| ·Ligation and transformation | 第170页 |
| ·Screening and identification of positive clones | 第170-171页 |
| 3. Establishment and identification of stably transfected hepatoma cells | 第171-172页 |
| ·Extraction of recombinant plasmids | 第171页 |
| ·Sensitivity of BEL7402 towards TRAIL | 第171页 |
| ·Screening of postivie clones | 第171页 |
| ·Identification of stably-transfected cells | 第171-172页 |
| Discussion | 第172-174页 |
| Section 2 Effects of HBx and MHBs(t) expression on TRAIL-induced apoptosis 161 Materials and methods | 第174-179页 |
| Materials and Methods | 第174-175页 |
| 1. Materials | 第174页 |
| 2. Methods | 第174-175页 |
| ·Cytotoxicity of TRAIL | 第174页 |
| ·Morphologic changes of cells induced by TRAIL | 第174-175页 |
| ·Apoptosis rate detected by TUNEL | 第175页 |
| Results | 第175页 |
| 1. Cytotoxicity rate detected by MTT | 第175页 |
| 2. Morphorlogic changes under inverted microscope | 第175页 |
| 3. Apoptosis rates detected by TUNEL | 第175页 |
| Discussion | 第175-179页 |
| Section 3 Molecular mechanisms of HBx and MHBs(t) effects on TRAIL-induced apoptosis | 第179-191页 |
| Materials and methods | 第179-183页 |
| 1. Materials | 第179-180页 |
| 2. Methods | 第180-183页 |
| ·Extracellular detection | 第180-181页 |
| ·Intracellular detection | 第181-183页 |
| Results | 第183-186页 |
| 1. Effects of HBx and MHBs(t) on the expression of TRAIL receptors | 第183-184页 |
| ·Semi-quantitative RT-PCR | 第183页 |
| ·Western blot | 第183页 |
| ·Flow cytometry | 第183-184页 |
| 2. Effects of HBx,MHBs(t) on TRAIL-pathway molecules | 第184-186页 |
| ·Activation level of caspase 3 | 第184页 |
| ·Mitochondria-independent pathway | 第184-185页 |
| ·Mitochondria-dependent pathway | 第185-186页 |
| Discussion | 第186-191页 |
| Section 4 Reversion of Bax siRNA on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis.178 Materials and methods | 第191-204页 |
| Materials and methods | 第191-196页 |
| 1. Materials | 第191-192页 |
| 2. Methods | 第192-196页 |
| ·Inhibition of positive control siRNA vector on GAPDH | 第192-195页 |
| ·Selection of effective siRNA vector for Bax | 第195-196页 |
| ·Effects of Bax blockade on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis | 第196页 |
| ·Effects of Bax blockade on the activation of TRAIL-signaling molecules 183 Results | 第196页 |
| Results | 第196-198页 |
| 1. Inhibition of positive control siRNA vector on GAPDH | 第196-197页 |
| ·Successful construction of positive and negative siRNA vectors | 第196-197页 |
| ·Effective inhibition of GAPDH by positive control siRNA vector | 第197页 |
| 2. Selection of efficient siRNA vector for Bax | 第197-198页 |
| ·DNA sequencing of Bax siRNA vectors | 第197页 |
| ·Inhibition of Bax expression by siRNA vector | 第197-198页 |
| 3. Reversion of Bax siRNA on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis | 第198页 |
| 4. Effects of Bax siRNA on the activation of apoptotic pathway molecules | 第198页 |
| Discussion | 第198-203页 |
| Conclusion | 第203-204页 |
| Part III Study of HBx effects on TRAIL-induced apoptosis in vivo | 第204-212页 |
| Materials and methods | 第204-208页 |
| 1. Materials | 第204-206页 |
| 2. Methods | 第206-208页 |
| ·Extraction ofpcDNA3 and pcDNA-HBx in bulk | 第206页 |
| ·In vitro amplification, titration, activity detection of adenovirus | 第206-207页 |
| ·Expression of HBx and Ad-TRAIL in mouse liver | 第207页 |
| ·Effects of HBx on the liver injury induced by TRAIL adenovirus | 第207-208页 |
| Results | 第208-209页 |
| 1. Extraction of plasmids in bulk | 第208页 |
| 2. Amplification, titration and activity detection of adenovirus | 第208-209页 |
| ·Cytopathic effects of HEK293 cells infected with adenovirus | 第208页 |
| ·Plaque formation assay | 第208页 |
| ·Activity of TRAIL adenovirus | 第208-209页 |
| 3. Expression of HBx in mouse liver | 第209页 |
| ·Semi-quantitative RT-PCR for HBx mRNA | 第209页 |
| ·Western blot for HBx protein | 第209页 |
| 4. Effects of HBx expression on TRAIL-induced apoptosis in vivo | 第209页 |
| ·ALT level in serum | 第209页 |
| ·Pathological changes in different tissues | 第209页 |
| ·Apoptosis of hepatocytes | 第209页 |
| Discussion | 第209-211页 |
| Conclusion | 第211-212页 |
| 中英文共用目录 | 第212-250页 |
| 附图 | 第212-232页 |
| 参考文献 | 第232-243页 |
| 致谢 | 第243-244页 |
| Acknowledgements | 第244-245页 |
| 博士在读期间发表论文、论著目录及所获荣誉 | 第245-247页 |
| Publications and honors | 第247-250页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第250页 |
