| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-15页 |
| 1 绪论 | 第15-39页 |
| ·虫生真菌的侵染循环 | 第16页 |
| ·绿僵菌杀虫机理研究进展 | 第16-24页 |
| ·绿僵菌对寄主的识别与粘附 | 第16-17页 |
| ·绿僵菌侵入寄主机理 | 第17-23页 |
| ·绿僵菌进入寄主体内后的作用机制 | 第23-24页 |
| ·磷酸酶研究现状 | 第24-34页 |
| ·碱性磷酸酶 | 第25-26页 |
| ·酸性磷酸酶 | 第26-27页 |
| ·丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶 | 第27-29页 |
| ·酪氨酸蛋白磷酸酶(Protein tyrosine phosphatases, PTPs, EC3.1.3.48) | 第29-30页 |
| ·磷酸酶在病原菌侵入寄主中的作用 | 第30-34页 |
| ·本研究的目的意义 | 第34-36页 |
| ·研究内容及技术路线 | 第36-38页 |
| ·主要研究内容 | 第36页 |
| ·研究的技术路线 | 第36-38页 |
| ·本文的创新点 | 第38-39页 |
| 2 培养条件对绿僵菌产胞外磷酸酶的影响 | 第39-53页 |
| ·引言 | 第39页 |
| ·材料与方法 | 第39-43页 |
| ·实验菌株及基本培养基 | 第39页 |
| ·主要仪器设备 | 第39-40页 |
| ·主要溶液及配制 | 第40-41页 |
| ·供试菌株培养及分生孢子悬浮液的制备 | 第41页 |
| ·酸性磷酸酶活性测定方法 | 第41页 |
| ·绿僵菌生物量测定方法 | 第41页 |
| ·培养条件对绿僵菌产酸性磷酸酶和生物量的影响 | 第41-42页 |
| ·粗酶液的制备及蛋白浓度的测定 | 第42页 |
| ·垂直等电聚焦电泳及酸性磷酸酶同工酶分析 | 第42-43页 |
| ·粗酶液的酸性磷酸酶活性的热稳定性 | 第43页 |
| ·结果与分析 | 第43-49页 |
| ·培养基pH、绿僵菌接种孢子浓度和通气效率对绿僵菌产酸性磷酸酶和生物量的影响 | 第43-45页 |
| ·不同碳源和氮源对绿僵菌产酸性磷酸酶和生物量的影响 | 第45-46页 |
| ·无机磷不同起始浓度对绿僵菌产酸性磷酸酶和生物量的影响 | 第46页 |
| ·不同磷源对绿僵菌产酸性磷酸酶及生物量的影响 | 第46-48页 |
| ·在优化培养条件下绿僵菌生长及酸性磷酸酶活性随培养时间的动态变化 | 第48页 |
| ·温度对粗酶液中磷酸酶活性的影响 | 第48-49页 |
| ·问题与讨论 | 第49-51页 |
| ·当用酵母膏、蛋白胨和牛肉浸膏培养时蛋白酶活性高，而用酪蛋白培养时产生的蛋白酶活性很低，甚至比只用低无机磷培养时还低 | 第49-50页 |
| ·绿僵菌在不同磷源条件下产生不同的磷酸酶 | 第50页 |
| ·在粗酶液的热稳定性实验中，粗酶液中的有部分酸性磷酸酶活性在20℃ 的条件下也很快丧失 | 第50页 |
| ·粗酶液在60℃、70℃ 和75℃ 水浴过程中，从15min 到225min 期间，酸性磷酸酶的活性持续上升。而在50℃ 水浴时，酶活性从225min 才开始上升 | 第50-51页 |
| ·本章小结 | 第51-53页 |
| 3 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的纯化及其特性研究 | 第53-85页 |
| ·引言 | 第53-55页 |
| ·蛋白分离纯化及特性研究的目的意义 | 第53页 |
| ·蛋白分离纯化常用的方法与策略 | 第53-55页 |
| ·本实验的原则和纯化技术路线 | 第55页 |
| ·材料与方法 | 第55-62页 |
| ·实验菌株及培养条件 | 第55-56页 |
| ·主要仪器设备 | 第56-57页 |
| ·主要试剂 | 第57-58页 |
| ·主要溶液及配制 | 第58-59页 |
| ·酸性磷酸酶活性及酪氨酸蛋白磷酸酶活性分析测定 | 第59页 |
| ·待纯化样品的制备 | 第59-60页 |
| ·ConA-Sepharose 48 亲和层析 | 第60页 |
| ·离子交换层析 | 第60页 |
| ·天然等电聚焦凝胶电泳(IEF-PAGE)及磷酸酶等电点(pI)测定 | 第60页 |
| ·天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 及表观分子量的测定 | 第60-61页 |
| ·磷酸酶特性研究 | 第61-62页 |
| ·结果与分析 | 第62-78页 |
| ·酶的纯化 | 第62-65页 |
| ·酶纯度鉴定和酶分子量及等电点测定 | 第65-67页 |
| ·酶的底物特异性 | 第67-69页 |
| ·酶的最适温度及其热稳定性分析 | 第69-70页 |
| ·金龟子绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的最适pH 及其pH 稳定性分析 | 第70-71页 |
| ·酶的动力学特性——米氏常数(Km)分析 | 第71-72页 |
| ·磷酸酶特异抑制剂对酶活性的影响 | 第72-73页 |
| ·金属离子对酶活性的影响 | 第73-78页 |
| ·无机磷对酶活性的反馈抑制 | 第78页 |
| ·酶的糖基含量分析 | 第78页 |
| ·问题与讨论 | 第78-82页 |
| ·蛋白分离纯化策略的制定 | 第78-79页 |
| ·酶蛋白纯度的鉴定 | 第79-80页 |
| ·磷酸酶的类型确定 | 第80-81页 |
| ·酶的热稳定性 | 第81-82页 |
| ·本章小结 | 第82-85页 |
| 4 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的基因克隆及分析 | 第85-131页 |
| ·引言 | 第85-87页 |
| ·基因克隆的意义 | 第85页 |
| ·基因克隆常用方法 | 第85-87页 |
| ·本实验克隆绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的基因的技术路线 | 第87页 |
| ·材料与方法 | 第87-98页 |
| ·主要仪器设备 | 第87-88页 |
| ·主要质粒、试剂及培养基 | 第88-89页 |
| ·主要溶液及配制 | 第89页 |
| ·酶蛋白的鉴定 | 第89-90页 |
| ·绿僵菌总DNA 提取分离、定量及检测 | 第90-91页 |
| ·绿僵菌全基因组文库的构建 | 第91-92页 |
| ·大肠杆菌(JM109)感受态的制备及转化 | 第92-93页 |
| ·PCR 产物的琼脂糖凝胶回收 | 第93页 |
| ·绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的文库筛选 | 第93-95页 |
| ·绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的cDNA 克隆 | 第95-98页 |
| ·引物合成及核酸序列测定 | 第98页 |
| ·绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因及氨基酸序列特性分析 | 第98页 |
| ·结果与分析 | 第98-125页 |
| ·酪氨酸蛋白磷酸酶的肽质量指纹分析图谱及其搜索比对结果 | 第98-100页 |
| ·绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的多肽de novo 测序 | 第100-104页 |
| ·绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因PCR 扩增 | 第104-106页 |
| ·酪氨酸蛋白磷酸酶基因的3’-RACE 和5’-RACE cDNA 序列克隆 | 第106-111页 |
| ·金龟子绿僵菌基因组文库的构建及其质量评估 | 第111-113页 |
| ·绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的文库筛选 | 第113-121页 |
| ·蛋白氨基酸序列相似性及其糖基化、磷酸化位点等性质分析 | 第121-125页 |
| ·问题与讨论 | 第125-129页 |
| ·未知蛋白的鉴定 | 第125-127页 |
| ·该磷酸酶基因克隆中的问题与方法 | 第127-128页 |
| ·酪氨酸蛋白磷酸酶基因序列分析 | 第128-129页 |
| ·本章小结 | 第129-131页 |
| 5 蝗虫血淋巴中绿僵菌 PTPase 的靶标分析 | 第131-139页 |
| ·引言 | 第131页 |
| ·材料与方法 | 第131-135页 |
| ·东亚飞蝗 | 第131页 |
| ·主要仪器设备 | 第131页 |
| ·主要试剂及配制 | 第131-132页 |
| ·蝗虫血淋巴的收集 | 第132页 |
| ·蝗虫血浆的磷酸化蛋白的亲和层析 | 第132页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第132页 |
| ·蝗虫血淋巴与纯化的PTPase 作用 | 第132-133页 |
| ·双向电泳 | 第133-134页 |
| ·PDQUEST 软件分析蛋白差异点 | 第134-135页 |
| ·肽指纹图谱分析 | 第135页 |
| ·结果与分析 | 第135-137页 |
| ·凝胶图谱匹配性分析 | 第135页 |
| ·凝胶图谱重复性分析 | 第135页 |
| ·磷酸化蛋白差异点分析 | 第135-136页 |
| ·差异点蛋白MALDI-TOF-MS 质谱分析及比对结果 | 第136-137页 |
| ·讨论 | 第137-139页 |
| 6 主要研究结论及后续研究建议 | 第139-143页 |
| ·主要研究结论 | 第139-141页 |
| ·培养基pH、孢子接种浓度、通气效率不同的氮源和碳源及磷源对绿僵菌生长及产酸性磷酸酶都有很大影响 | 第139页 |
| ·蛋白纯化及特性研究 | 第139-140页 |
| ·酪氨酸蛋白磷酸酶基因克隆及分析 | 第140-141页 |
| ·蝗虫血淋巴中绿僵菌PTPase 的靶标分析 | 第141页 |
| ·后续工作建议 | 第141-143页 |
| 致谢 | 第143-145页 |
| 参考文献 | 第145-165页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间论文发表的论文目录 | 第165-166页 |
| 独创性声明 | 第166页 |
| 学位论文版权使用授权书 | 第166页 |
