| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 缩略词表 | 第9-10页 |
| 第一章前言 | 第10-18页 |
| 1. 研究背景 | 第10-15页 |
| ·抗菌肽的研究现状 | 第10-11页 |
| ·抗菌肽DCD-1L的研究进展 | 第11-12页 |
| ·蛋白质分子的体外定向进化研究进展 | 第12-13页 |
| ·定向进化的策略 | 第12页 |
| ·构建突变文库的载体系统 | 第12-13页 |
| ·文库筛选策略 | 第13页 |
| ·毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第13-15页 |
| 2. 研究目的和意义 | 第15-18页 |
| 第二章材料与方法 | 第18-32页 |
| 1. 材料 | 第18-22页 |
| ·主要仪器设备 | 第18-19页 |
| ·主要试剂 | 第19-20页 |
| ·试剂配制 | 第20-21页 |
| ·培养基制备 | 第21-22页 |
| ·菌株和载体 | 第22页 |
| ·引物 | 第22页 |
| 2. 方法 | 第22-32页 |
| ·质粒载体pGAPZαC的制备 | 第22-24页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第22-23页 |
| ·转化感受态细胞 | 第23页 |
| ·质粒的增殖与保存 | 第23页 |
| ·质粒载体pGAPZαC的抽提 | 第23-24页 |
| ·抗菌肽DCD1L基因的制备 | 第24-26页 |
| ·引物设计 | 第24-25页 |
| ·重叠延伸PCR法合成目的基因 | 第25页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第25-26页 |
| ·目的基因的酶切分析及回收 | 第26页 |
| ·目的基因的酶切分析 | 第26页 |
| ·压碎与浸泡法回收 | 第26页 |
| ·质粒载体的酶切分析及回收 | 第26-27页 |
| ·质粒载体的酶切分析 | 第26页 |
| ·普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收 | 第26-27页 |
| ·酶切后片段与载体的连接 | 第27-28页 |
| ·连接体系及反应 | 第27页 |
| ·验证连接反应 | 第27-28页 |
| ·重组表达载体pGAPZαC-DCD-1L电转化毕赤酵母菌SMD1168 | 第28-29页 |
| ·重组载体的线性化及纯化 | 第28页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第28页 |
| ·电穿孔 | 第28-29页 |
| ·重组菌株的鉴定 | 第29-30页 |
| ·毕赤酵母基因组的提取 | 第29-30页 |
| ·重组菌株的PCR鉴定 | 第30页 |
| ·重组酵母菌株的表达 | 第30-31页 |
| ·表达及蛋白样品制备 | 第30页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测表达产物 | 第30-31页 |
| ·重组毕赤酵母菌株的筛选 | 第31-32页 |
| 第三章 结果 | 第32-39页 |
| 1. 质粒pGAPZαC的制备 | 第32页 |
| 2. 抗菌肽DCD-1L基因的制备 | 第32页 |
| 3. 抗菌肽DCD-1L基因的双酶切及回收 | 第32-33页 |
| 4. 质粒载体的双酶切分析及回收 | 第33-34页 |
| 5. 酶切片断与酶切载体的连接反应 | 第34-35页 |
| ·引物P4和pGAP Forward验证连接反应 | 第34页 |
| ·引物P3和3’AOX I验证连接反应 | 第34-35页 |
| 6. 电转化法转化毕赤酵母菌Pichia pastorisSMD1168 | 第35-38页 |
| ·转化率 | 第35-36页 |
| ·重组菌株鉴定 | 第36-38页 |
| ·引物P3和3'AOX I的重组菌株鉴定 | 第36-37页 |
| ·引物pGAP Forward和3'AOX I的重组菌株鉴定 | 第37-38页 |
| 7. 重组菌株在酵母菌SMD1168中的表达 | 第38页 |
| 8. 抗菌肽筛选 | 第38-39页 |
| 第四章 讨论 | 第39-42页 |
| 1. 抗菌肽DCD-1L | 第39页 |
| 2. 分泌型表达的设计 | 第39-40页 |
| 3. 关于酵母偏爱密码子的选用 | 第40页 |
| 4. 表达载体与毕赤酵母染色体的整合 | 第40-41页 |
| 5. 突变基因文库 | 第41-42页 |
| 结论 | 第42-43页 |
| 参考文献 | 第43-46页 |
| 致谢 | 第46-47页 |
| 附图 | 第47-48页 |
