| 第一章 前言 | 第1-13页 |
| ·生物合成1,3-PDO | 第10-11页 |
| ·新型甘油脱水酶同源基因 | 第11页 |
| ·蛋白质工程 | 第11-13页 |
| 第二章 材料与方法 | 第13-23页 |
| ·实验材料 | 第13-14页 |
| ·菌株与质粒 | 第13页 |
| ·酶与试剂 | 第13页 |
| ·主要仪器设备 | 第13-14页 |
| ·方法与步骤 | 第14-23页 |
| ·Escherichia coli基因组总DNA的制备 | 第14页 |
| ·丙酮酸甲酸裂解酶及其激活因子(pfl)的引物设计和PCR扩增 | 第14-15页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第15-16页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第16-17页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第17页 |
| ·DNA的酶切与连接 | 第17页 |
| ·连接产物对大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第17页 |
| ·阳性克隆筛选和酶切验证 | 第17页 |
| ·重组子的质粒PCR验证 | 第17-18页 |
| ·重组菌株的诱导表达 | 第18页 |
| ·重组酶粗酶的制备 | 第18页 |
| ·丙酮酸甲酸裂解酶酶活力的测定 | 第18-19页 |
| ·外源基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE | 第19页 |
| ·蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第19页 |
| ·突变点的确定和突变引物的设计 | 第19-20页 |
| ·定点突变的方法 | 第20-21页 |
| ·突变体的构建 | 第21-22页 |
| ·最适温度和最适pH的测定方法 | 第22页 |
| ·Km值的粗测 | 第22页 |
| ·半衰期的测定方法 | 第22页 |
| ·Tm值的测定方法 | 第22-23页 |
| 第三章 结果与分析 | 第23-32页 |
| ·野生型丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)表达质粒的构建 | 第23-25页 |
| ·pfl基因的克隆 | 第23-24页 |
| ·野生型pfl重组表达质粒的构建 | 第24-25页 |
| ·野生型pfl的SDS-PAGE分析 | 第25页 |
| ·突变型丙酮酸甲酸裂解酶基因表达质粒的构建 | 第25-28页 |
| ·突变型pfl的扩增 | 第25-26页 |
| ·突变型pfl基因的序列分析 | 第26-27页 |
| ·突变型和野生型pfl基因的SDS-PAGE分析 | 第27-28页 |
| ·野生型和突变型PFL基因的特性比较 | 第28-32页 |
| ·最适温度和最适pH的比较 | 第28-29页 |
| ·粗测Km值的比较 | 第29-30页 |
| ·半衰期的比较 | 第30页 |
| ·Tm值的比较 | 第30-32页 |
| 第四章 讨论 | 第32-34页 |
| ·预测算法 | 第32-33页 |
| ·突变点的分析 | 第33-34页 |
| 第五章 结论与展望 | 第34-37页 |
| ·结论 | 第34-35页 |
| ·问题与展望 | 第35-37页 |
| 参考文献 | 第37-41页 |
| 附录 | 第41-45页 |
| 致谢 | 第45-46页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第46页 |
