| 前言 | 第1-17页 |
| 1 研究目的和意义 | 第11页 |
| 2 肉毒毒素研究进展 | 第11-17页 |
| ·毒素的来源和分布 | 第11页 |
| ·肉毒毒素的理化性质和提取方法 | 第11-12页 |
| ·肉毒毒素的理化性质 | 第11-12页 |
| ·临床用肉毒毒素的制备 | 第12页 |
| ·肉毒毒素结构和作用方式 | 第12-14页 |
| ·降低释放机制的Ca~(2+)敏感性 | 第12-13页 |
| ·对胆碱能突触的专一性 | 第13页 |
| ·毒素结合区与其受体 | 第13-14页 |
| ·L链是酪氨酸特异蛋白激酶的底物 | 第14页 |
| ·BoNT检测及预防 | 第14-15页 |
| ·生物学试验方法 | 第14页 |
| ·免疫学试验方法 | 第14-15页 |
| ·PCR方法 | 第15页 |
| ·肉毒毒素中毒特点和预防 | 第15-17页 |
| ·肉毒毒素中毒的临床特点 | 第15-16页 |
| ·抗肉毒毒素蛋白疫苗的研究 | 第16-17页 |
| 第一章 A型肉毒毒素重链C末端保护性抗原的制备 | 第17-27页 |
| 1 材料和方法 | 第17-23页 |
| ·材料 | 第17-18页 |
| ·质粒和菌株 | 第17页 |
| ·试剂 | 第17页 |
| ·主要仪器设备 | 第17-18页 |
| ·主要液体试剂 | 第18页 |
| ·方法 | 第18-23页 |
| ·BoNT／AHc编码序列的优化设计与合成 | 第18-20页 |
| ·叠式PCR | 第20页 |
| ·连接反应 | 第20页 |
| ·细菌的转化 | 第20页 |
| ·菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第20-21页 |
| ·酶切鉴定阳性克隆 | 第21页 |
| ·转化表达菌株 | 第21页 |
| ·重组BoNTAHc的诱导表达 | 第21页 |
| ·Ni-NTA亲和层析柱制备 | 第21页 |
| ·重组BoNT／A的亲和纯化与复性 | 第21-22页 |
| ·Bradford法对重组BoNT／AHc蛋白进行定量 | 第22页 |
| ·重组BoNT／AHc蛋白的鉴定 | 第22-23页 |
| 2 结果 | 第23-26页 |
| ·BoNT／AHc编码序列的优化设计 | 第23-24页 |
| ·BoNT／AHc编码序列的合成与序列分析 | 第24页 |
| ·重组BoNT／AHc蛋白的表达 | 第24-25页 |
| ·重组BoNT／AHc蛋白的纯化和复性 | 第25-26页 |
| ·重组BoNT／AHc蛋白鉴定 | 第26页 |
| 3 分析和讨论 | 第26-27页 |
| 第二章 BoNT／A单克隆抗体的制备和免疫学特性鉴定 | 第27-38页 |
| 1 材料和方法 | 第27-33页 |
| ·材料 | 第27-29页 |
| ·主要试剂 | 第27页 |
| ·仪器设备 | 第27页 |
| ·细胞 | 第27页 |
| ·培养基和缓冲液 | 第27-29页 |
| ·方法 | 第29-33页 |
| ·重组抗原的制备 | 第29页 |
| ·小鼠免疫 | 第29页 |
| ·饲养细胞的制备 | 第29页 |
| ·脾细胞的制备 | 第29页 |
| ·细胞融合 | 第29-30页 |
| ·融合细胞的培养 | 第30页 |
| ·筛选(Screening) | 第30页 |
| ·克隆(Cloning) | 第30页 |
| ·体外扩大培养 | 第30页 |
| ·细胞冻存 | 第30-31页 |
| ·小鼠腹水制备 | 第31页 |
| ·单抗效价的测定 | 第31页 |
| ·杂交瘤细胞染色体鉴定 | 第31页 |
| ·亚类鉴定 | 第31-32页 |
| ·腹水单克隆抗体的纯化 | 第32页 |
| ·抗体纯度的鉴定 | 第32页 |
| ·蛋白绝对含量测定 | 第32页 |
| ·单克隆抗体的交叉反应性 | 第32页 |
| ·单克隆抗体的亲和力的测定 | 第32-33页 |
| 2 结果 | 第33-36页 |
| ·细胞融合 | 第33页 |
| ·杂交瘤克隆化结果 | 第33页 |
| ·单抗分类及效价测定 | 第33-34页 |
| ·单克隆抗体表位鉴定 | 第34页 |
| ·抗体亲和力测定 | 第34页 |
| ·单抗纯化结果 | 第34-35页 |
| ·纯化得率 | 第34-35页 |
| ·三株单抗腹水纯化的SDS-PAGE电泳鉴定 | 第35页 |
| ·稳定性实验 | 第35-36页 |
| ·杂交瘤细胞染色体鉴定 | 第36页 |
| 3 讨论 | 第36-38页 |
| ·融合和阳性株筛选 | 第36-37页 |
| ·单抗的特异性鉴定 | 第37页 |
| ·关于单抗的纯化方法 | 第37页 |
| ·关于三株单抗抗原表位的鉴定 | 第37-38页 |
| 第三章 多克隆抗体及酶标抗体的制备与鉴定 | 第38-44页 |
| 1 材料和方法 | 第38-41页 |
| ·材料 | 第38页 |
| ·方法 | 第38-41页 |
| ·抗原的制备 | 第38页 |
| ·动物免疫 | 第38页 |
| ·抗血清的采集 | 第38-39页 |
| ·抗血清效价的测定 | 第39页 |
| ·抗血清多抗的纯化 | 第39页 |
| ·特异性鉴定 | 第39页 |
| ·纯化样品鉴定 | 第39页 |
| ·酶标抗体的制备与鉴定 | 第39-41页 |
| 2 结果 | 第41-43页 |
| ·动物免疫 | 第41-42页 |
| ·抗血清的特异性鉴定 | 第42页 |
| ·抗血清纯化结果 | 第42-43页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测结果 | 第42-43页 |
| 3 分析和讨论 | 第43-44页 |
| ·酶标抗体的质量鉴定 | 第43页 |
| ·酶标抗体的纯化 | 第43页 |
| ·酶结合物的免疫学活性 | 第43-44页 |
| 第四章 肉毒毒素(BoNT／A)ELISA检测方法的建立和试剂盒的组装 | 第44-52页 |
| 1 材料和方法 | 第44-46页 |
| ·材料 | 第44页 |
| ·方法 | 第44-46页 |
| ·抗体最佳包被浓度的选择 | 第44页 |
| ·抗体最佳包被条件的选择 | 第44页 |
| ·间接竞争ELISA法检测步骤的确定 | 第44页 |
| ·双抗夹心ELISA法检测步骤的确定 | 第44-45页 |
| ·线性范围及检测限的确定 | 第45页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第45页 |
| ·测定人工污染样品中BoNT／A的回收率 | 第45页 |
| ·试剂盒组装和操作 | 第45-46页 |
| 2 结果 | 第46-49页 |
| ·抗体最佳包被浓度的选择 | 第46页 |
| ·抗体最佳包被条件的选择 | 第46-47页 |
| ·间接竞争ELISA条件的建立 | 第47页 |
| ·夹心ELISA试剂盒条件分析 | 第47-48页 |
| ·试剂盒检测BoNT／A的标准曲线制备 | 第48-49页 |
| ·人工污染样品中BoNT／A的回收率 | 第49页 |
| ·稳定性试验 | 第49页 |
| 3 分析和讨论 | 第49-52页 |
| ·抗体校价确定 | 第50页 |
| ·抗体的纯度和蛋白含量鉴定 | 第50页 |
| ·抗体的浓度确定 | 第50页 |
| ·试剂盒检测的灵敏度 | 第50页 |
| ·试剂盒检测的特异性 | 第50-51页 |
| ·结果判定与计算 | 第51-52页 |
| 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-59页 |
| 缩略词表 | 第59-60页 |
| 作者简介 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
