| 英文缩写词 | 第1-10页 |
| 中文摘要 | 第10-14页 |
| 英文摘要 | 第14-19页 |
| 实验研究 | 第19-104页 |
| 第一部分：人TRAIL基因的克隆表达及其纯化工艺的研究 | 第19-56页 |
| 1 前言 | 第19-20页 |
| 2 实验材料 | 第20-26页 |
| ·试剂 | 第20-25页 |
| ·仪器 | 第25-26页 |
| 3 实验方法 | 第26-36页 |
| ·PCR反应引物的配制 | 第26页 |
| ·PCR扩增反应及流程 | 第26页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第26页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第26-27页 |
| ·小样质粒的抽提纯化 | 第27页 |
| ·DNA及质粒的酶切反应 | 第27页 |
| ·外源DNA片段与质粒的连接 | 第27-28页 |
| ·琼脂糖电泳DNA片段的回收 | 第28页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒的转化 | 第28-29页 |
| ·工程菌pET-11a-TRAIL／BL21的诱导表达 | 第29页 |
| ·SDS-PAGE | 第29-30页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶的染色及脱色 | 第30-31页 |
| ·发酵罐规模的发酵 | 第31-32页 |
| ·细菌的裂解和包涵体的制备 | 第32页 |
| ·包涵体的溶解和复性 | 第32页 |
| ·复性后样品的浓缩和目标产物的纯化 | 第32-33页 |
| ·纯度鉴定——蛋白质的银染 | 第33页 |
| ·纯度鉴定——HPLC | 第33页 |
| ·TRAIL蛋白鉴别实验——Western blotting | 第33-35页 |
| ·Lowry蛋白含量测定 | 第35页 |
| ·重组人TRAIL蛋白的活性检测 | 第35-36页 |
| 4 实验结果 | 第36-48页 |
| ·全长人TRAIL cDNA的PCR扩增反应 | 第36页 |
| ·全长人TRAIL cDNA的克隆和酶切分析 | 第36页 |
| ·全长人TRAIL cDNA的序列分析 | 第36-38页 |
| ·可溶型人TRAIL(114-281 amino acid)基因的PCR扩增反应 | 第38页 |
| ·可溶型人TRAIL cDNA的克隆和酶切反应 | 第38-39页 |
| ·可溶型人TRAIL cDNA的序列分析 | 第39页 |
| ·重组表达质粒pET-11a-TRAIL(114-281 amino acid)的构建 | 第39页 |
| ·基因工程菌pET-11a-TRAIL(114-281 amino acid)／BL21的诱导表达 | 第39页 |
| ·工程菌pET-11a-TRAIL(114-281 amino acid)／BL21的发酵 | 第39-41页 |
| ·发酵菌体的裂解和包涵体的纯化 | 第41-42页 |
| ·包涵体的变性、复性及复性液的浓缩 | 第42页 |
| ·重组可溶性人TRAIL的纯化 | 第42页 |
| ·目标蛋白的鉴别实验——Western blotting | 第42-43页 |
| ·重组可溶性人TRAIL的纯度检测 | 第43页 |
| ·重组可溶性人TRAIL的N-端15个氨基酸的序列分析 | 第43页 |
| ·重组可溶性人TRAIL的活性检测 | 第43-48页 |
| 5 讨论 | 第48-52页 |
| ·TRAIL选择性的诱导肿瘤细胞凋亡作用 | 第48-49页 |
| ·人TRAIL基因的克隆表达 | 第49-50页 |
| ·基因工程菌pET-11a-sTRAIL／BL21的发酵及其纯化工艺的摸索和建立 | 第50-51页 |
| ·重组人TRAIL活性检测的建立 | 第51-52页 |
| ·重组人TRAIL主要质控指标的建立 | 第52页 |
| 6 小结 | 第52-53页 |
| 7.参考文献 | 第53-56页 |
| 第二部分：TRAIL抗肿瘤作用及其部分机制 | 第56-104页 |
| 1.前言 | 第56-57页 |
| 2 实验材料 | 第57-61页 |
| ·试剂 | 第57-61页 |
| ·仪器 | 第61页 |
| 3 实验方法 | 第61-68页 |
| ·A549细胞培养及体外抗肿瘤活性 | 第61页 |
| ·流式细胞仪检测重组人sTRAIL体外的抗肿瘤活性 | 第61-62页 |
| ·透射电镜检测重组人sTRAIL对肿瘤细胞A549的诱导凋亡作用 | 第62页 |
| ·化疗药物与重组人sTRAIL体外协同抗肿瘤活性 | 第62-64页 |
| ·各组抑制率的计算 | 第64页 |
| ·Western印迹实验的细胞裂解样品的制备 | 第64页 |
| ·Lowry蛋白定量 | 第64-65页 |
| ·12％SDS-PAGE | 第65-66页 |
| ·Western印迹实验 | 第66-67页 |
| ·A549细胞的培养及细胞悬液的制备 | 第67页 |
| ·肿瘤发生率抑制实验 | 第67-68页 |
| ·肿瘤形成后的荷瘤裸鼠的体内抑制肿瘤生长实验 | 第68页 |
| ·统计学处理 | 第68页 |
| 4.结果 | 第68-86页 |
| ·sTRAIL对人肺癌A549细胞的体外抗肿瘤活性的浓度---效应关系 | 第68-69页 |
| ·sTRAIL对人肺癌A549细胞的体外抗肿瘤活性的时间---效应关系 | 第69-72页 |
| ·sTRAIL作用于人肺癌A549细胞的透射电镜观察实验 | 第72-73页 |
| ·化疗药物与sTRAIL协同作用于人肺癌A549细胞 | 第73-83页 |
| ·A549细胞死亡受体和假受体的表达 | 第83-84页 |
| ·sTRAIL和sTRAIL／cisplatin对荷瘤裸鼠肿瘤发生率的影响 | 第84-85页 |
| ·sTRAIL和sTRAIL／cisplatin抑制荷瘤裸鼠新生肿瘤生长的抑制曲线 | 第85-86页 |
| ·sTRAIL和sTRAIL／cisplatin抑制荷瘤裸鼠新生肿瘤生长的抑制结果 | 第86页 |
| ·肿瘤形成后的荷瘤裸鼠模型的体内抗肿瘤作用 | 第86页 |
| 5.讨论 | 第86-96页 |
| ·TRAIL体外抗肿瘤活性的研究 | 第88页 |
| ·TRAIL的诱导肿瘤细胞凋亡作用 | 第88-89页 |
| ·Act D、Taxol和cisplatin与TRAIL的协同抗肿瘤活性研究 | 第89-91页 |
| ·Act D、Taxol和cisplatin与TRAIL的协同诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制及对A549细胞膜表面死亡受体和假受体的表达影响 | 第91-93页 |
| ·sTRAIL对人肺癌A549细胞荷瘤裸鼠肿瘤发生率的影响 | 第93-94页 |
| ·sTRAIL／cisplatin对人肺癌A549细胞荷瘤裸鼠的协同抗肿瘤作用 | 第94-95页 |
| ·sTRAIL对人肺癌A549细胞荷瘤裸鼠动物模型的体内抗肿瘤效应与剂量之间的关系 | 第95-96页 |
| 6.小结 | 第96-97页 |
| 7.参考文献 | 第97-104页 |
| 本研究的创新点 | 第104-105页 |
| 整体研究示意图 | 第105-106页 |
| 个人简历 | 第106-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 文献综述 | 第109-161页 |
| 细胞凋亡及其TRAIL诱导肿瘤细胞的研究进展 | 第109-137页 |
| 参考文献 | 第137-161页 |
