| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 引言 | 第8-35页 |
| 第一节 藻胆蛋白研究进展 | 第9-19页 |
| 1 藻胆蛋白的生化组成及存在形式 | 第10-12页 |
| 2 藻胆蛋白的结构研究进展 | 第12-13页 |
| 3 藻胆蛋白的基因工程研究进展 | 第13-15页 |
| 4 藻胆蛋白的功能研究进展 | 第15-19页 |
| ·藻胆蛋白具有重要的理论研究价值 | 第15-16页 |
| ·作为藻体内的储存蛋白 | 第16页 |
| ·藻胆蛋白荧光性质的利用 | 第16-17页 |
| ·藻胆蛋白的生物学活性 | 第17-19页 |
| 第二节 基因工程制药研究进展 | 第19-21页 |
| 1 基因工程药物概述 | 第19-20页 |
| 2 基因工程药物发展现状 | 第20-21页 |
| 第三节 基因工程菌的高密度发酵研究进展 | 第21-27页 |
| 1 宿主菌的选择 | 第22页 |
| 2 培养条件的选择 | 第22-24页 |
| ·营养物质 | 第22-23页 |
| ·溶氧 | 第23页 |
| ·温度 | 第23页 |
| ·pH | 第23-24页 |
| ·其它影响因素 | 第24页 |
| 3 高密度发酵中存在的问题 | 第24-25页 |
| 4 高密度发酵过程中补料方式的选择 | 第25-27页 |
| 第四节 基因工程菌表达产物的分离纯化 | 第27-30页 |
| 1 菌体的破碎 | 第28页 |
| 2 目标蛋白的浓缩与初步纯化 | 第28页 |
| 3 重组蛋白的精细纯化 | 第28-30页 |
| 第五节 基因工程药物的质量控制 | 第30-33页 |
| 1 纯度分析 | 第31页 |
| 2 杂质检测 | 第31页 |
| 3 蛋白质性质鉴定 | 第31-33页 |
| 4 安全性评价 | 第33页 |
| 第六节 本论文工作研究的目标、意义及总体路线 | 第33-35页 |
| 第二章 基因工程菌培养条件的优化及高密度发酵 | 第35-63页 |
| 第一节 基因工程菌株P1摇瓶培养条件的优化 | 第35-45页 |
| 1 材料与方法 | 第35-38页 |
| ·基因工程菌P1的培养 | 第35页 |
| ·菌体浓度的测定 | 第35-36页 |
| ·菌体可溶性总蛋白含量的测定 | 第36-37页 |
| ·葡萄糖浓度的测定 | 第37页 |
| ·rAPC表达量的测定 | 第37-38页 |
| ·质粒稳定性的测定 | 第38页 |
| 2 结果和讨论 | 第38-44页 |
| ·培养基的优化 | 第38-40页 |
| ·培养条件的优化 | 第40-42页 |
| ·诱导条件的优化 | 第42-44页 |
| 3 小结 | 第44-45页 |
| 第二节 基因工程菌株P1 5L高密度发酵研究 | 第45-50页 |
| 1 材料与方法 | 第45-46页 |
| ·菌体的培养 | 第45页 |
| ·分析方法 | 第45-46页 |
| 2 结果和讨论 | 第46-49页 |
| ·流加方式的选择 | 第46页 |
| ·三种补料流加形式发酵中生物量及生长规律比较 | 第46-47页 |
| ·三种补料形式发酵液中残糖浓度的对比 | 第47-48页 |
| ·三种补料流加形式质粒稳定性的对比 | 第48-49页 |
| 3 小结 | 第49-50页 |
| 第三节 基因工程菌株P1 20L中试规模发酵工艺的探索 | 第50-54页 |
| 1 材料与方法 | 第50页 |
| ·基因工程菌P1的培养 | 第50页 |
| ·分析方法 | 第50页 |
| 2 结果及讨论 | 第50-53页 |
| ·菌体不同培养条件的选择 | 第50-51页 |
| ·不同发酵策略中生物量的对比 | 第51-53页 |
| 3 小结 | 第53-54页 |
| 第四节 乳糖诱导镭普克(rAPC)在工程菌JR1的表达研究 | 第54-63页 |
| 1 材料和方法 | 第54-56页 |
| ·转化质粒的制备 | 第54-55页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备及质粒转化 | 第55页 |
| ·菌体的培养 | 第55-56页 |
| ·分析方法 | 第56页 |
| 2 结果和讨论 | 第56-62页 |
| ·rAPC在基因工程菌株JR1中的表达 | 第56-57页 |
| ·不同培养基对于菌体生长和rAPC表达的影响 | 第57-58页 |
| ·加入无机盐对rAPC产率的影响 | 第58-59页 |
| ·起始诱导时机的优化 | 第59页 |
| ·诱导剂乳糖浓度的优化 | 第59-60页 |
| ·诱导后持续时间对表达的影响 | 第60-61页 |
| ·不同诱导剂对rAPC表达的影响 | 第61页 |
| ·基因工程菌JR1的5L发酵 | 第61-62页 |
| 3 小结 | 第62-63页 |
| 第三章 镭普克(rAPC)纯化工艺路线和质控体系的建立 | 第63-83页 |
| 第一节 镭普克(rAPC)纯化工艺路线的建立 | 第63-71页 |
| 1 材料和方法 | 第63-65页 |
| ·实验材料 | 第63-64页 |
| ·实验方法 | 第64-65页 |
| 2 结果和讨论 | 第65-70页 |
| ·硫酸铵分级沉淀 | 第65页 |
| ·rAPC的亲和层析纯化 | 第65-67页 |
| ·rAPC的离子交换层析纯化 | 第67-68页 |
| ·rAPC的疏水层析纯化 | 第68-69页 |
| ·rAPC的凝胶过滤层析纯化 | 第69页 |
| ·rAPC纯化工艺路线的建立 | 第69-70页 |
| 3 小结 | 第70-71页 |
| 第二节 镭普克(rAPC)质控体系的建立 | 第71-83页 |
| 1 材料和方法 | 第71-77页 |
| ·SDS-PAGE | 第71页 |
| ·Native -PAGE | 第71-72页 |
| ·高效液相层析色谱(HPLC) | 第72页 |
| ·免疫印迹(Western-blot)分析 | 第72-74页 |
| ·等电聚焦电泳 | 第74-75页 |
| ·肽图分析 | 第75-76页 |
| ·凝胶过滤法测定rAPC的分子量 | 第76-77页 |
| ·最大紫外吸收波长测定(λmax) | 第77页 |
| 2 结果和讨论 | 第77-82页 |
| ·rAPC的纯度鉴定 | 第77-79页 |
| ·rAPC 的非特异性鉴定 | 第79页 |
| ·rAPC的免疫原性鉴定 | 第79-80页 |
| ·rAPC的等电点测定 | 第80页 |
| ·rAPC的分子量测定 | 第80-81页 |
| ·rAPC的肽图鉴定 | 第81页 |
| ·rAPC的最大紫外吸收波长(λmax)测定 | 第81-82页 |
| 3 小结 | 第82-83页 |
| 第四章 镭普克(rAPC)的抗肿瘤活性研究 | 第83-92页 |
| 第一节 镭普克(rAPC)抗肿瘤药效学实验 | 第83-87页 |
| 1 材料和方法 | 第83-85页 |
| ·rAPC的体外抗肿瘤实验 | 第83-84页 |
| ·rAPC的体内抗肿瘤实验 | 第84-85页 |
| 2 结果和讨论 | 第85-86页 |
| ·rAPC的体外抗肿瘤研究 | 第85页 |
| ·rAPC对小鼠S-180肉瘤的抑制作用 | 第85-86页 |
| ·rAPC对小鼠H22肝癌瘤模型的抑制作用 | 第86页 |
| 3 小结 | 第86-87页 |
| 第二节 镭普克(rAPC)抗肿瘤免疫机理的研究 | 第87-90页 |
| 1 材料和方法 | 第87-88页 |
| ·rAPC对小鼠脾细胞增殖功能的影响 | 第87页 |
| ·rAPC在体内对小鼠抗体、补体分泌功能的影响 | 第87-88页 |
| ·rAPC对小鼠脾细胞细胞因子分泌功能的影响 | 第88页 |
| 2 结果和讨论 | 第88-90页 |
| ·rAPC对小鼠T、B淋巴细胞增殖反应功能的影响作用 | 第88页 |
| ·rAPC对小鼠脾细胞的细胞因子分泌功能的影响作用 | 第88-89页 |
| ·rAPC体内腹腔给药对B细胞功能的作用 | 第89-90页 |
| 3 小结 | 第90页 |
| 第三节 镭普克(rAPC)的急性毒性实验 | 第90-92页 |
| 1 材料和方法 | 第90页 |
| 2 结果讨论 | 第90-91页 |
| 3 小结 | 第91-92页 |
| 结论 | 第92-93页 |
| 使用仪器 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-107页 |
| 发表及已完成文章目录 | 第107-108页 |
| 致谢 | 第108页 |
