| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| Chapter Ⅰ Literature Review | 第14-31页 |
| 1.1.Definition the causative agents of brucellosis | 第14页 |
| 1.2.clinical manifestations and transmission | 第14-15页 |
| 1.3.Pathogenesis of Brucella infection | 第15-16页 |
| 1.4.Immune response to Brucella infection | 第16页 |
| 1.5.The genome of Brucella spp | 第16-17页 |
| 1.6.Diagnosis of Brucellosis: | 第17-23页 |
| 1.6.1.Direct methods for diagnosis of Brucella spp.infection | 第18-21页 |
| 1.6.1.1.Bacteriological methods | 第18-19页 |
| 1.6.1.2.Molecular methods | 第19-21页 |
| 1.6.2.In-direct diagnosis of brucellosis | 第21-23页 |
| 1.6.2.1.Serological tests | 第21页 |
| 1.6.2.2.Rose Bengal Plate test (RBPT) | 第21-22页 |
| 1.6.2.3.Complement fixation test | 第22页 |
| 1.6.2.4.Enzyme-linked Immunosorbent Assay | 第22页 |
| 1.6.2.5.Native hapten gel precipitation tests | 第22页 |
| 1.6.2.6.Fluorescence polarization assay | 第22-23页 |
| 1.6.2.7.Milk ring test (MRT) | 第23页 |
| 1.6.2.8.Buffered plate antigen test (BPAT) | 第23页 |
| 1.6.3.Cell-mediated immunity (CMI) based diagnosis | 第23页 |
| 1.7.Prevention,Control,and Eradication of animal brucellosis | 第23-24页 |
| 1.8.Recombinase Polymerase Amplification(RPA) | 第24-31页 |
| 1.8.1.Overview | 第24页 |
| 1.8.2.RPA reaction components | 第24-25页 |
| 1.8.3.RPA parameters | 第25-27页 |
| 1.8.3.1.Primers and Probes characteristics | 第25页 |
| 1.8.3.2.Temperature | 第25页 |
| 1.8.3.3.Incubation time | 第25页 |
| 1.8.3.4.Mixing and crowding agents | 第25-26页 |
| 1.8.3.5.Presence of RPA inhibitors | 第26页 |
| 1.8.3.6.Multiplex RPA | 第26-27页 |
| 1.8.4.Detection of RPA amplicon | 第27-31页 |
| 1.8.4.1.Lateral flow dipstick | 第27页 |
| 1.8.4.2.Agarose gel electrophoresis | 第27-28页 |
| 1.8.4.3.Bridge flocculation assay | 第28页 |
| 1.8.4.4.DVDs and low reflectivity DVDs | 第28页 |
| 1.8.4.5.Colorimetric detection | 第28页 |
| 1.8.4.6.Quantum dot(QD)barcodes | 第28-29页 |
| 1.8.4.7.Electrochemical transduction | 第29页 |
| 1.8.4.8.Real-time detection | 第29页 |
| 1.8.4.9.Modifications of Real-time detection | 第29-30页 |
| 1.8.4.10.Conclusion | 第30-31页 |
| Chapter Ⅱ Establishment of Recombinase Polymerase Amplification(RPA)for detection of Brucella spp.infection in animals | 第31-41页 |
| 2.1.Introduction | 第31-32页 |
| 2.2.Materials and methods | 第32-35页 |
| 2.2.1.Samples collection | 第32页 |
| 2.2.2.DNA extraction of Bacterial strains and samples | 第32页 |
| 2.2.3.Development and optimization of RPA | 第32-33页 |
| 2.2.3.1.Candidate primers and probes design | 第32页 |
| 2.2.3.2.Recombinase polymerase amplification(RPA)development and optimization | 第32-33页 |
| 2.2.4.Validation of RPA | 第33-35页 |
| 2.2.4.1.Analytical sensitivity and detection limit | 第33-34页 |
| 2.2.4.2.Analytical specificity | 第34页 |
| 2.2.4.3.Diagnostic sensitivity | 第34页 |
| 2.2.4.4.Recombinase polymerase amplification | 第34页 |
| 2.2.4.5.Polymerase chain reaction(PCR) | 第34-35页 |
| 2.2.4.6.Real time PCR | 第35页 |
| 2.2.4.7.Rose Bengal Plate test(RBPT) | 第35页 |
| 2.2.5.Statistical analysis | 第35页 |
| 2.3.Results | 第35-39页 |
| 2.3.1.Optimization of RPA: | 第35-36页 |
| 2.3.2.Analytical sensitivity and detection limit results | 第36-37页 |
| 2.3.3.Analytical specificity | 第37-38页 |
| 2.3.4.Comparison of diagnostic sensitivity and specificity of RPA,Real time PCR and PCR | 第38页 |
| 2.3.5.Comparison of diagnostic sensitivity of RPA with Rose Bengal Plate test(RBPT) | 第38-39页 |
| 2.4.Discussion | 第39-41页 |
| Chapter Ⅲ Development of the Lateral-flow dipstick combined with SYBR green I Recombinase Polymerase Amplification(RPA)for diagnosis of Brucella spp.infection | 第41-51页 |
| 3.1.Introduction | 第41-42页 |
| 3.2.Materials and Methods | 第42-45页 |
| 3.2.1.The samples | 第42页 |
| 3.2.2.Genomic DNA extraction | 第42页 |
| 3.2.3.Recombinant plasmid construction | 第42-43页 |
| 3.2.4.RPA development and optimization | 第43-44页 |
| 3.2.4.1.RPA primers and Probe design | 第43页 |
| 3.2.4.2.Optimization of RPA conditions | 第43-44页 |
| 3.2.4.3.Lateral flow dipstick(LFD)and SYBR Green I assays | 第44页 |
| 3.2.4.4.Analytical sensitivity and detection limit | 第44页 |
| 3.2.4.5.Analytical specificity | 第44页 |
| 3.2.5.Screening of field samples | 第44页 |
| 3.2.6.Real-time PCR | 第44-45页 |
| 3.2.7.Statistical analysis | 第45页 |
| 3.3.Results | 第45-49页 |
| 3.3.1.RPA optimum conditions and robustness | 第45-46页 |
| 3.3.2.Analytical sensitivity and detection limit | 第46页 |
| 3.3.3.Analytical specificity | 第46-48页 |
| 3.3.4.Screening of field samples by RPA,Real-time PCR,and PCR | 第48-49页 |
| 3.4.Discussion | 第49-51页 |
| Chapter Ⅳ Development of Duplex Recombinase Polymerase Amplification for detection of Brucella melitensis and Brucella abortus | 第51-61页 |
| 4.1.Introduction | 第51页 |
| 4.2.Materials and Methods | 第51-54页 |
| 4.2.1.Bacterial strains | 第51-52页 |
| 4.2.2.Collection of samples | 第52页 |
| 4.2.3.Selection of specific sequences,Bioinformatics analysis and Primers design | 第52页 |
| 4.2.4.Duplex Recombinase Polymerase Amplification(Duplex RPA) | 第52页 |
| 4.2.5.Analytical sensitivity and specificity | 第52-53页 |
| 4.2.6.Real-time PCR(Bounaadja et al.,2009) | 第53页 |
| 4.2.7.Multiplex AMOS PCR | 第53-54页 |
| 4.2.8.Screening of field samples with Duplex RPA and AMOS PCR | 第54页 |
| 4.2.9.Statistical analysis | 第54页 |
| 4.3.Results | 第54-58页 |
| 4.3.1.Detection of Bacterial strains by AMOS PCR | 第54-55页 |
| 4.3.2.Sequences alignments and primers pairs | 第55-56页 |
| 4.3.3.Analytical sensitivity and specificity | 第56-57页 |
| 4.3.4.Results of screening field samples | 第57-58页 |
| 4.4.Discussion | 第58-61页 |
| Conclusion | 第61-62页 |
| REFERENCES | 第62-71页 |
| Appendix | 第71-84页 |
| Acknowledgements | 第84-85页 |
| Author's Curriculum Vitae | 第85-87页 |
