| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-9页 |
| 文献综述 | 第13-19页 |
| 第一章 纳米抗体用于病毒抗性基因筛选评述 | 第13-19页 |
| 1.1 研究进展 | 第13-16页 |
| 1.1.1 病毒结构蛋白纳米抗体 | 第13-15页 |
| 1.1.2 病毒非结构蛋白纳米抗体 | 第15-16页 |
| 1.2 存在问题 | 第16页 |
| 1.3 发展对策 | 第16页 |
| 1.4 应用前景 | 第16-18页 |
| 1.5 本研究的目的与意义 | 第18-19页 |
| 试验研究 | 第19-62页 |
| 第二章 慢病毒表达载体的改造 | 第19-27页 |
| 2.1 试验材料 | 第19-20页 |
| 2.1.1 质粒、菌株、细胞 | 第19页 |
| 2.1.2 主要试剂与主要仪器 | 第19页 |
| 2.1.3 引物设计与合成 | 第19-20页 |
| 2.2 方法 | 第20-23页 |
| 2.2.1 负筛标签Ccdb-Cm片段PCR扩增 | 第20页 |
| 2.2.2 慢病毒表达载体pCD513B-1和胶回收产物致死基因Ccdb-Cm片段的酶切 | 第20-21页 |
| 2.2.3 连接 | 第21页 |
| 2.2.4 感受态细胞DB3.1的制备和连接产物的转化 | 第21-22页 |
| 2.2.5 菌液pCD513B-1-Ccdb-Cm的PCR鉴定 | 第22-23页 |
| 2.2.6 质粒pCD513B-1-Ccdb-Cm酶切鉴定 | 第23页 |
| 2.3 实验结果 | 第23-25页 |
| 2.3.1 致死基因Ccdb-Cm的胶回收 | 第23-24页 |
| 2.3.2 载体pCD513B-1-Ccdb-Cm的菌液PCR鉴定与酶切鉴定 | 第24-25页 |
| 2.4 讨论 | 第25-26页 |
| 2.5 小结 | 第26-27页 |
| 第三章 慢病毒免疫纳米抗体文库的构建及其鉴定 | 第27-39页 |
| 3.1 试验材料 | 第27-28页 |
| 3.1.1 菌株与质粒同第二章 | 第27页 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器设备 | 第27页 |
| 3.1.3 试验动物及疫苗 | 第27-28页 |
| 3.2 方法 | 第28-32页 |
| 3.2.1 纳米抗体库VHH片段的获得 | 第28-30页 |
| 3.2.2 pCD513B-1-Ccdb-Cm载体和VHH片段的酶切。 | 第30页 |
| 3.2.3 连接 | 第30-31页 |
| 3.2.5 收集文库菌落 | 第31页 |
| 3.2.6 文库的质量评定 | 第31-32页 |
| 3.3 结果与分析 | 第32-37页 |
| 3.3.1 淋巴细胞的分离及RNA提取 | 第32页 |
| 3.3.2 VHH片段扩增 | 第32-33页 |
| 3.3.3 重组载体pCD513B-1-VHH的酶切鉴定 | 第33-35页 |
| 3.3.4 抗体库的构建和插入率检测 | 第35页 |
| 3.3.5 文库的丰度和多样性鉴定 | 第35-37页 |
| 3.4 讨论 | 第37-38页 |
| 3.5 小结 | 第38-39页 |
| 第四章 稳定表达VHHS基因的IEC和VERO细胞系的构建 | 第39-48页 |
| 4.1 实验材料 | 第39页 |
| 4.1.1 菌株,质粒与细胞 | 第39页 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器设备详见附录 | 第39页 |
| 4.2 方法 | 第39-41页 |
| 4.2.1 主要试剂配方 | 第39页 |
| 4.2.2 慢病毒颗粒的包装 | 第39-40页 |
| 4.2.3 病毒的滴度测定详见附录。 | 第40页 |
| 4.2.4 稳定表达VHH的IEC和Vero细胞系的构建 | 第40页 |
| 4.2.5 Westernblotting检测VHH的表达 | 第40-41页 |
| 4.3 实验结果 | 第41-46页 |
| 4.3.1 慢病毒包装质粒的制备与纯化 | 第41页 |
| 4.3.2 慢病毒的包装 | 第41-42页 |
| 4.3.3 慢病毒的滴度测定 | 第42-43页 |
| 4.3.4 稳定表达VHH的IEC和Vero细胞系的构建 | 第43-46页 |
| 4.4 讨论 | 第46-47页 |
| 4.5 小结 | 第47-48页 |
| 第五章 抗PEDV病毒的基因的筛选及其功能验证 | 第48-62页 |
| 5.1 实验材料 | 第48页 |
| 5.1.1 菌株、质粒与细胞同第四章 | 第48页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第48页 |
| 5.1.3 主要仪器设备 | 第48页 |
| 5.1.4 主要溶液和培养基的配置详见附录 | 第48页 |
| 5.2 方法 | 第48-52页 |
| 5.2.1 抗PEDV病毒的目的基因的筛选 | 第48-52页 |
| 5.2.2 抗PEDV病毒的目的基因功能验证 | 第52页 |
| 5.3 结果与分析 | 第52-60页 |
| 5.3.1 细胞RNA提取 | 第52-53页 |
| 5.3.2 VHH-P片段扩增 | 第53页 |
| 5.3.3 慢病毒VHH-P菌落PCR鉴定 | 第53-54页 |
| 5.3.4 pCD513B-1-VHH-P2和pCD513B-1-VHH-P6的酶切鉴定 | 第54-55页 |
| 5.3.5 慢病毒载体的包装 | 第55-56页 |
| 5.3.6 病毒的滴度测定 | 第56-57页 |
| 5.3.7 pCD513B-1-VHH-P2-IEC与pCD513B-1-VHH-P6-IEC的细胞系的构建 | 第57-58页 |
| 5.3.8 基因VHH-P2和VHH-P6对PEDV增殖的影响 | 第58-60页 |
| 5.4 讨论 | 第60-61页 |
| 5.5 结果 | 第61-62页 |
| 结论 | 第62页 |
| 创新点 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-69页 |
| 附录 | 第69-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 作者简介 | 第77页 |
