| 中文摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-27页 |
| 引言 | 第11页 |
| 1.1 乳酸乳球菌酸耐受研究进展 | 第11-12页 |
| 1.2 sRNA发现、分类及研究方法 | 第12-14页 |
| 1.2.1 sRNA的发现和识别 | 第12-13页 |
| 1.2.2 生物信息学预测sRNA | 第13页 |
| 1.2.3 实验方法检测sRNA | 第13-14页 |
| 1.2.4 sRNA分类 | 第14页 |
| 1.3 sRNA调控mRNA研究方法的介绍 | 第14-17页 |
| 1.3.1 体内方法 | 第15-16页 |
| 1.3.2 体外方法 | 第16-17页 |
| 1.4 sRNA调控mRNA作用机制的探究 | 第17-21页 |
| 1.4.1 sRNA与RNA调节子之间的竞争 | 第18-19页 |
| 1.4.2 sRNA在不同的靶标之间的作用 | 第19-20页 |
| 1.4.3 sRNA和mRNA共同竞争结合蛋白 | 第20页 |
| 1.4.4 作用机制总结 | 第20-21页 |
| 1.5 sRNA的生物学作用 | 第21-24页 |
| 1.5.1 铁离子代谢 | 第21-23页 |
| 1.5.2 群体感应 | 第23-24页 |
| 1.5.3 毒力作用 | 第24页 |
| 1.6 本文的研究内容和研究目的 | 第24-27页 |
| 第2章 表型实验筛选sRNA042及其功能验证 | 第27-43页 |
| 2.1 实验材料与设备 | 第27-30页 |
| 2.1.1 实验所用菌种和培养基 | 第27-28页 |
| 2.1.2 实验药品和试剂 | 第28-30页 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-39页 |
| 2.2.1 乳酸乳球菌基因组的提取 | 第30-31页 |
| 2.2.2 引物设计与验证 | 第31-32页 |
| 2.2.3 质粒的提取 | 第32页 |
| 2.2.4 目的片段的扩增和回收 | 第32-33页 |
| 2.2.5 载体质粒与目的片段的酶切和连接 | 第33-34页 |
| 2.2.6 感受态大肠杆菌E.coliTG1的制备与转化 | 第34页 |
| 2.2.7 转化子的筛选与验证 | 第34-36页 |
| 2.2.8 乳酸乳球菌F44感受态的制备与转化 | 第36-37页 |
| 2.2.9 酸耐受检测 | 第37页 |
| 2.2.10 生长曲线及发酵液的测定 | 第37-38页 |
| 2.2.11 Nisin效价的检测 | 第38-39页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第39-42页 |
| 2.3.1 单个sRNA过表达菌株酸耐受分析 | 第39-40页 |
| 2.3.2 单个sRNA过表达生长情况分析 | 第40-41页 |
| 2.3.3 单个过表达sRNA产酸能力分析 | 第41页 |
| 2.3.4 单个sRNA过表达Nisin产量分析 | 第41-42页 |
| 2.4 本章小结 | 第42-43页 |
| 第3章 sRNA042的NortherBlot验证 | 第43-53页 |
| 3.1 实验材料 | 第44-45页 |
| 3.2 实验设备 | 第45-46页 |
| 3.3 实验方法 | 第46-49页 |
| 3.3.1 探针的制备 | 第46-47页 |
| 3.3.2 RNA的提取 | 第47页 |
| 3.3.3 电泳分离RNA | 第47-48页 |
| 3.3.4 转膜 | 第48页 |
| 3.3.5 紫外交联 | 第48页 |
| 3.3.6 预杂交 | 第48页 |
| 3.3.7 杂交 | 第48-49页 |
| 3.3.8 洗膜 | 第49页 |
| 3.3.9 封闭、显影 | 第49页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第49-53页 |
| 3.4.1 NorthernBlot方法验证结果分析 | 第49-51页 |
| 3.4.2 s042NorthernBlot验证的结果 | 第51页 |
| 3.4.3 实验总结 | 第51-53页 |
| 第4章 sRNA042的敲除 | 第53-65页 |
| 4.1 实验材料与设备 | 第53-54页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第53页 |
| 4.1.2 主要设备和仪器 | 第53页 |
| 4.1.3 培养基 | 第53-54页 |
| 4.2 实验方法 | 第54-57页 |
| 4.2.1 乳酸乳球菌基因组的提取 | 第54页 |
| 4.2.2 PCR引物的设计和验证 | 第54-55页 |
| 4.2.3 目标引物的大量扩增和回收 | 第55页 |
| 4.2.4 质粒提取和质粒与片段的酶切回收 | 第55页 |
| 4.2.5 感受态大肠杆菌E.coliTG1的制备与转化 | 第55页 |
| 4.2.6 转化子的筛选和验证 | 第55页 |
| 4.2.7 乳酸乳球菌电转化感受态的制备与电转化 | 第55页 |
| 4.2.8 乳酸乳球菌单交换突变菌株的筛选和验证 | 第55页 |
| 4.2.9 乳酸乳球菌双交换突变菌株的筛选和验证 | 第55-56页 |
| 4.2.10 消除氯霉素抗性基因 | 第56页 |
| 4.2.11 消除pNZTScre质粒 | 第56-57页 |
| 4.2.12 突变菌株测序鉴定 | 第57页 |
| 4.2.13 乳酸乳球菌耐酸性的测定 | 第57页 |
| 4.2.14 乳酸乳球菌生长曲线及其发酵液的测定 | 第57页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第57-63页 |
| 4.3.1 sRNA042敲除载体的构建 | 第57-59页 |
| 4.3.2 乳酸乳球菌单交换菌株验证 | 第59-60页 |
| 4.3.3 乳酸乳球菌双交换菌株的验证 | 第60-61页 |
| 4.3.4 氯霉素抗性基因的消除验证 | 第61页 |
| 4.3.5 载体pNZTS-cre消除验证 | 第61-62页 |
| 4.3.6 乳酸乳球菌耐酸性的测定 | 第62-63页 |
| 4.3.7 乳酸乳球菌生长曲线及其发酵液的测定 | 第63页 |
| 4.4 本章小结 | 第63-65页 |
| 第5章 sRNA042的靶标验证 | 第65-85页 |
| 5.1 实验材料与设备 | 第65页 |
| 5.1.1 实验试剂和培养基 | 第65页 |
| 5.1.2 主要仪器和设备 | 第65页 |
| 5.2 实验方法 | 第65-78页 |
| 5.2.1 基于在线软件的靶标预测 | 第65-75页 |
| 5.2.2 sRNA靶标验证菌株的构建 | 第75-76页 |
| 5.2.3 sRNA靶标验证菌株的荧光检测 | 第76页 |
| 5.2.4 总RNA的提取及cDNA的合成 | 第76-77页 |
| 5.2.5 实时荧光定量PCR验证 | 第77-78页 |
| 5.2.6 实时荧光定量PCR的相对定量 | 第78页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第78-84页 |
| 5.3.1 sRNA与靶标结合位点的分析 | 第78-79页 |
| 5.3.2 sRNA靶标验证荧光强度变化 | 第79-80页 |
| 5.3.3 sRNA和靶标基因之间的相互作用 | 第80-83页 |
| 5.3.4 荧光定量PCR验证靶标基因转录量 | 第83页 |
| 5.3.5 AccD在脂肪酸合成代谢中的作用 | 第83-84页 |
| 5.4 本章小结 | 第84-85页 |
| 第6章 结论与展望 | 第85-87页 |
| 6.1 结论 | 第85-86页 |
| 6.2 展望 | 第86-87页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第87-89页 |
| 参考文献 | 第89-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
