| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 第一章 绪论 | 第17-48页 |
| 1. 枯草杆菌蛋白酶的研究概况 | 第17-31页 |
| 1.1 枯草杆菌蛋白酶的晶体结构 | 第18-20页 |
| 1.2 枯草杆菌蛋白酶的催化机制 | 第20-23页 |
| 1.3 枯草杆菌蛋白酶的底物特异性 | 第23-28页 |
| 1.4 枯草杆菌蛋白酶的稳定性研究 | 第28-31页 |
| 2. 蛋白质工程技术研究概况 | 第31-38页 |
| 2.1 定点突变技术 | 第31-32页 |
| 2.2 随机突变技术 | 第32-38页 |
| 2.2.1 化学诱变技术 | 第33页 |
| 2.2.2 易错PCR技术 | 第33页 |
| 2.2.3 DNA重排技术 | 第33-34页 |
| 2.2.4 体外随机引发重组技术 | 第34页 |
| 2.2.5 交错延伸技术 | 第34-38页 |
| 3. 纳豆激酶(NK)研究进展 | 第38-42页 |
| 3.1 纳豆和NK简介 | 第38页 |
| 3.2 NK的研究现状 | 第38-42页 |
| 3.2.1 物理化学性质研究 | 第38页 |
| 3.2.2 分子生物学研究 | 第38-39页 |
| 3.2.3 溶解血栓作用研究 | 第39-40页 |
| 3.2.4 酶学性质研究 | 第40-42页 |
| 4. 研究方法 | 第42-46页 |
| 4.1 等温滴定量热(ITC)技术在酶促反应动力学研究中的应用 | 第42-44页 |
| 4.2 计算机分子动力学模拟技术在蛋白质研究中的应用 | 第44-46页 |
| 5. 本论文的选题意义及研究内容 | 第46-48页 |
| 第二章 实验材料与实验方法 | 第48-76页 |
| 第一节 实验材料 | 第48-50页 |
| 1. 载体构建相关材料 | 第48页 |
| 2. 蛋白表达及纯化相关材料 | 第48页 |
| 3. Western blotting相关材料 | 第48-49页 |
| 4. 酶活力测定相关材料 | 第49页 |
| 5. 仪器 | 第49-50页 |
| 第二节 实验方法 | 第50-76页 |
| 1. 细菌培养 | 第50页 |
| 2. DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第50-51页 |
| 3. 纳豆枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取 | 第51-52页 |
| 4. 聚合酶链式反应(PCR)扩增NK基因 | 第52-55页 |
| 5. PCR产物及酶切产物的回收 | 第55-56页 |
| 6. 质粒的提取 | 第56-58页 |
| 7. 双酶切全长基因及pET-28a质粒 | 第58-59页 |
| 8. 连接双酶切质粒和基因 | 第59-60页 |
| 9. 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第60-61页 |
| 10. 质粒转化大肠杆菌感受态细胞 | 第61页 |
| 11. 阳性克隆的鉴定 | 第61-63页 |
| 12. 重组蛋白的表达 | 第63页 |
| 13. 重组蛋白的纯化 | 第63-65页 |
| 14. Ni柱的再生 | 第65-66页 |
| 15. 蛋白浓度的测定 | 第66页 |
| 16. 重组蛋白的鉴定 | 第66-68页 |
| 17. 酶活力的测定 | 第68-70页 |
| 17.1 纤维蛋白平板法测酶的纤溶活力 | 第68-69页 |
| 17.2 四肽底物法测酶的酰胺水解活力 | 第69-70页 |
| 18. 等温滴定量热法(ITC)测酶动力学常数和热动力学参数 | 第70-72页 |
| 19. 酶的抗氧化活性测定 | 第72-73页 |
| 20. 酶的热稳定性测定 | 第73-74页 |
| 21. 圆二色光谱法(CD)测重组蛋白的二级结构 | 第74页 |
| 22. 荧光光谱法检测突变对重组蛋白结构的影响 | 第74-76页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第76-143页 |
| 第一节 NK在大肠杆菌BL21中的表达 | 第76-95页 |
| 1. 研究背景与立项依据概述 | 第76-77页 |
| 2. 结果与讨论 | 第77-94页 |
| 2.1 重组质粒的构建与鉴定 | 第77-89页 |
| 2.2 信号肽和前导肽对NK在大肠杆菌BL21中表达成熟的影响 | 第89-91页 |
| 2.3 酶自身活性对NK在大肠杆菌BL21中表达成熟的影响 | 第91-94页 |
| 3. 结论 | 第94-95页 |
| 第二节 NK酶活性研究 | 第95-110页 |
| 1. 研究背景与立项依据概述 | 第95-96页 |
| 2. 结果与讨论 | 第96-109页 |
| 2.1 突变体I31L重组质粒的构建与鉴定 | 第96-99页 |
| 2.2 目的蛋白表达与鉴定 | 第99-101页 |
| 2.3 酶促反应动力学常数测定 | 第101-105页 |
| 2.4 纤溶活力测定 | 第105-107页 |
| 2.5 计算机分子动力学模拟研究突变对酶活性的影响 | 第107-109页 |
| 3. 结论 | 第109-110页 |
| 第三节 NK稳定性研究 | 第110-143页 |
| 1. 研究背景与立项依据概述 | 第110-111页 |
| 2. 结果与讨论 | 第111-142页 |
| 2.1 NK抗氧化活性研究 | 第112-131页 |
| 2.1.1 突变体NK(M222A和T220S)重组质粒的构建与鉴定 | 第112-116页 |
| 2.1.2 双突变体NK(M222A/I31L和T220S/I31L)重组质粒的构建与鉴定 | 第116-119页 |
| 2.1.3 目的蛋白的表达与鉴定 | 第119-124页 |
| 2.1.4 酶促反应动力学常数测定 | 第124-125页 |
| 2.1.5 纤溶活力测定 | 第125-126页 |
| 2.1.6 抗氧化活性测定 | 第126-129页 |
| 2.1.7 光谱法检测突变对NK结构的影响 | 第129-130页 |
| 2.1.8 计算机分子动力学模拟研究突变对酶活性和抗氧化活性的影响 | 第130-131页 |
| 2.2 NK热稳定性研究 | 第131-142页 |
| 2.2.1 双突变体G61C/S98C重组质粒的构建与鉴定 | 第132-135页 |
| 2.2.2 双突变体NK(T22C/S87C和S24C/S87C)重组质粒的构建与鉴定 | 第135-138页 |
| 2.2.3 目的蛋白的表达与鉴定 | 第138-140页 |
| 2.2.4 热稳定性的测定 | 第140-142页 |
| 3. 结论 | 第142-143页 |
| 参考文献 | 第143-159页 |
| 攻读博士学位期间已发表和待发表的论文 | 第159-160页 |
| 致谢 | 第160页 |
