| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 主要符号对照表 | 第9-10页 |
| 第一章 引言 | 第10-11页 |
| 第二章 研究目的与意义 | 第11-18页 |
| 2.1 Kallistatin概述 | 第11-18页 |
| 2.1.1 组织激肽释放酶结合蛋白 | 第11-13页 |
| 2.1.2 肝纤维化 | 第13-15页 |
| 2.1.3 肝纤维化的诊断 | 第15页 |
| 2.1.4 肝纤维化的治疗 | 第15-18页 |
| 第三章 Kallistatin蛋白的毕赤酵母表达及纯化 | 第18-27页 |
| 3.1 毕赤酵母表达Kal蛋白 | 第18-20页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第18页 |
| 3.1.2 实验试剂 | 第18页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第18-19页 |
| 3.1.4 试剂配制 | 第19页 |
| 3.1.5 实验方法 | 第19-20页 |
| 3.2 Kal蛋白的纯化定性及定量 | 第20-22页 |
| 3.2.1 试剂配制 | 第20-21页 |
| 3.2.2 目的蛋白的纯化 | 第21页 |
| 3.2.3 SDA-PAGE电泳检测 | 第21-22页 |
| 3.2.4 Western Blot鉴定目的蛋白 | 第22页 |
| 3.2.5 BCA法测定总蛋白浓度 | 第22页 |
| 3.2.6 Elisa法测定目的蛋白浓度 | 第22页 |
| 3.3 统计分析 | 第22页 |
| 3.4 实验结果与分析 | 第22-27页 |
| 3.4.1 重组人组织激肽释放酶结合蛋白的制备 | 第22-24页 |
| 3.4.2 重组人组织激肽释放酶结合蛋白的纯化 | 第24页 |
| 3.4.3 SDS-PAGE鉴定 | 第24-27页 |
| 第四章 Kallistatin哺乳动物表达载体的构建 | 第27-35页 |
| 4.1 实验材料 | 第27-28页 |
| 4.1.1 试剂及耗材准备 | 第27页 |
| 4.1.2 培养基及溶液的配制 | 第27-28页 |
| 4.2 实验方法 | 第28-32页 |
| 4.2.1 引物设计 | 第28页 |
| 4.2.2 T载的构建与鉴定 | 第28-30页 |
| 4.2.3 大肠杆菌的转化及蓝白斑筛选 | 第30页 |
| 4.2.4 质粒的小量提取 | 第30-31页 |
| 4.2.5 测序 | 第31页 |
| 4.2.6 双酶切后的目的片段连接到pcDNA3.1(+)载体 | 第31-32页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第32-34页 |
| 4.3.1 pcDNA3.1-Kal载的构建与鉴定 | 第32-33页 |
| 4.3.2 重组表达质粒的测序结果 | 第33-34页 |
| 4.4 讨论 | 第34-35页 |
| 第五章 Kallistatin蛋白哺乳动物表达初探 | 第35-50页 |
| 5.1 实验材料 | 第35页 |
| 5.2 CHO细胞冻存与复苏的条件优化 | 第35-36页 |
| 5.1.1 冻存保护液对CHO细胞的影响 | 第35页 |
| 5.1.2 冻存条件对CHO细胞的影响 | 第35-36页 |
| 5.1.3 复苏方法对CHO细胞存活率的影响 | 第36页 |
| 5.3 PEI介导的瞬时转染条件优化 | 第36-37页 |
| 5.3.1PEI毒性试验 | 第36页 |
| 5.3.2 细胞转染方法 | 第36页 |
| 5.3.3 转染条件的优化 | 第36-37页 |
| 5.4 结果 | 第37-44页 |
| 5.4.1 保存和复苏条件的优化 | 第37-40页 |
| 5.4.2 转染条件的优化 | 第40-44页 |
| 5.5 讨论 | 第44-50页 |
| 5.5.1 宿主细胞的选择 | 第45-46页 |
| 5.5.2 表达载体的选择 | 第46页 |
| 5.5.3 转染试剂的选择 | 第46-48页 |
| 5.5.4 转染过程的优化 | 第48页 |
| 5.5.5 质粒的抽提及纯化 | 第48-50页 |
| 第六章 Kallistatin蛋白单克隆抗体制作初探 | 第50-59页 |
| 6.1 实验材料 | 第50页 |
| 6.1.1 实验动物 | 第50页 |
| 6.1.2 试剂与器材 | 第50页 |
| 6.2 实验方法 | 第50-51页 |
| 6.2.1 脾内免疫 | 第50页 |
| 6.2.2 皮下免疫 | 第50页 |
| 6.2.3 细胞融合 | 第50-51页 |
| 6.2.4 血清滴度检测 | 第51页 |
| 6.3 实验结果与分析 | 第51-53页 |
| 6.3.1 脾内免疫与皮下免疫结果对比 | 第51-52页 |
| 6.3.2 抗原使用量及佐剂优化实验 | 第52-53页 |
| 6.4 讨论 | 第53-59页 |
| 6.4.1 细胞融合前的准备 | 第54-55页 |
| 6.4.2 饲养细胞的制备 | 第55页 |
| 6.4.3 细胞融合的主要方法 | 第55-56页 |
| 6.4.4 杂交瘤细胞的筛选 | 第56页 |
| 6.4.5 克隆化技术 | 第56-57页 |
| 6.4.6 单克隆杂交瘤细胞的扩大培养 | 第57-58页 |
| 6.4.7 无血清培养液在杂交瘤细胞培养中的应用 | 第58页 |
| 6.4.8 杂交瘤细胞的冻存和复苏 | 第58页 |
| 6.4.9 单抗的效价鉴定及纯化 | 第58-59页 |
| 第七章 讨论与展望 | 第59-61页 |
| 7.1 毕赤酵母蛋白的表达 | 第59页 |
| 7.2 哺乳动物表达 | 第59页 |
| 7.3 小鼠抗体制作 | 第59页 |
| 7.4 本研究的创新点 | 第59-60页 |
| 7.5 未来研究计划 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
