| 中文摘要 | 第9-11页 |
| 英文摘要 | 第11-13页 |
| 前言 | 第14-16页 |
| 第一部分 pcDNA3.1-V5/His B-N045874表达质粒的构建 | 第16-29页 |
| 材料和方法 | 第16-23页 |
| 1. 材料 | 第16-18页 |
| 1.1 细胞株、菌种及实验动物 | 第16页 |
| 1.2 引物及载体 | 第16页 |
| 1.3 主要实验仪器和试剂 | 第16-17页 |
| 1.4 常见溶液配制 | 第17-18页 |
| 2. 方法 | 第18-23页 |
| 2.1 Hca-P细胞株传代及保种 | 第18页 |
| 2.2 RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）法扩增N045874全长 | 第18-20页 |
| 2.3 pEASY-blunt simple-N045874克隆质粒的构建 | 第20-21页 |
| 2.4 连接产物的转化与蓝白斑筛选 | 第21页 |
| 2.5 筛选并鉴定阳性克隆 | 第21-22页 |
| 2.6 pcDNA3.1/V5-His B-N045874真核表达质粒构建及鉴定 | 第22-23页 |
| 结果 | 第23-25页 |
| 1. 目的基因N045874的PCR产物鉴定 | 第23页 |
| 2. pEASY-blunt simple-N045874克隆质粒的双酶切鉴定 | 第23-24页 |
| 3. pcDNA3.1/V5-HisB-N045874表达质粒的酶切鉴定 | 第24页 |
| 4. pcDNA3.1/V5-HisB-N045874表达质粒测序鉴定结果 | 第24-25页 |
| 讨论 | 第25-26页 |
| 结论 | 第26页 |
| 参考文献 | 第26-29页 |
| 第二部分 N045874过表达对Hca-P体外转移能力的影响 | 第29-38页 |
| （一）材料与方法 | 第29-32页 |
| 1. 材料 | 第29页 |
| 1.1 细胞株、引物和真核表达质粒 | 第29页 |
| 1.2 主要实验仪器和试剂 | 第29页 |
| 2. 方法 | 第29-32页 |
| 2.1 实时荧光定量PCR（q RT-PCR） | 第29-31页 |
| 2.2 N045874表达质粒转染至Hca-P细胞 | 第31页 |
| 2.3 Transwell法检测N045874过表达对Hca-P迁移能力影响 | 第31-32页 |
| 2.4 Transwell法检测N045874过表达对Hca-P侵袭能力影响 | 第32页 |
| 2.5 计数检测N045874过表达对Hca-P增殖能力的影响 | 第32页 |
| 2.6 统计学分析 | 第32页 |
| （二）结果 | 第32-35页 |
| 1. N045874在Hca-P中低表达 | 第32-33页 |
| 2. 瞬时转染Hca-P细胞，N045874的表达水平的变化 | 第33页 |
| 3. N045874过表达增强Hca-P细胞体外转移能力 | 第33-34页 |
| 4. N045874过表达对Hca-P体外增殖能力无影响 | 第34页 |
| 5. N045874上调对EMT相关分子的影响 | 第34-35页 |
| （三）讨论 | 第35-36页 |
| （四）结论 | 第36页 |
| （五）参考文献 | 第36-38页 |
| 第三部分 N045874通过靶向调控mmu-miR3303p影响Hca-P转移力 | 第38-52页 |
| （一）材料和方法 | 第38-45页 |
| 1. 材料 | 第38页 |
| 1.1 细胞株和真核表达载体 | 第38页 |
| 1.2 引物及载体 | 第38页 |
| 1.3 主要实验仪器和试剂 | 第38页 |
| 2. 方法 | 第38-45页 |
| 2.1 mmu-miR3303p表达质粒转染Hca-P | 第38-39页 |
| 2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第39页 |
| 2.3 N045874与mmu-miR3303p结合位点野生型与突变型双荧光素报告质粒引物的设计与合成 | 第39-41页 |
| 2.4 N045874双荧光素野生型克隆质粒的构建 | 第41-42页 |
| 2.5 N045874双荧光素野生型表达质粒的构建 | 第42-43页 |
| 2.6 N045874双荧光素突变型表达质粒的构建 | 第43-44页 |
| 2.7 双荧光素酶活力检测 | 第44-45页 |
| 2.8 mmu-miR3303p与N045874共转染至Hca-P细胞 | 第45页 |
| 2.9 统计学分析 | 第45页 |
| （二）结果 | 第45-50页 |
| 1. psicheck2-N045874野生型目的片段的获取 | 第45页 |
| 2. pMD19-N045874野生型克隆质粒的双酶切鉴定 | 第45-46页 |
| 3. psicheck2-N045874野生型表达质粒的酶切鉴定 | 第46页 |
| 4. 野生型表达质粒测序鉴定结果 | 第46-47页 |
| 5. psicheck2-N045874突变型分段片段的获取 | 第47页 |
| 6. psicheck2-N045874突变型目的片段的获取 | 第47页 |
| 7. pMD19-N045874突变型克隆质粒的双酶切鉴定 | 第47页 |
| 8. psicheck2-N045874突变型表达质粒的酶切鉴定 | 第47页 |
| 9. 突变型表达质粒测序鉴定结果 | 第47-48页 |
| 10. 双荧光素报告实验 | 第48-49页 |
| 11. q PCR法检测相关基因的表达 | 第49页 |
| 12. N045874与mmu-mi R3303p对Hca-P细胞体外转移的影响 | 第49-50页 |
| （三）讨论 | 第50页 |
| （四）结论 | 第50-51页 |
| （五）参考文献 | 第51-52页 |
| 综述 | 第52-63页 |
| 参考文献 | 第58-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
