| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 引言 | 第10-11页 |
| 1 文献综述 | 第11-23页 |
| 1.1 溶菌酶概述 | 第11-17页 |
| 1.1.1 溶菌酶的分类 | 第11-12页 |
| 1.1.2 溶菌酶的结构及作用 | 第12-14页 |
| 1.1.3 溶菌酶的应用 | 第14-16页 |
| 1.1.4 溶菌酶的生产状况及前景 | 第16-17页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 | 第17-22页 |
| 1.2.1 毕赤酵母的生物学特性 | 第17-18页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达系统的优点 | 第18页 |
| 1.2.3 毕赤酵母表达载体和宿主的选择 | 第18-20页 |
| 1.2.4 影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素 | 第20-22页 |
| 1.3 本实验研究目的及意义 | 第22-23页 |
| 2 柞蚕溶菌酶基因的克隆及表达载体的构建 | 第23-31页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验试剂与器材 | 第23-24页 |
| 2.2.1 主要试剂与材料 | 第23-24页 |
| 2.2.2 主要实验仪器 | 第24页 |
| 2.2.3 主要溶液及配制方法 | 第24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-28页 |
| 2.3.1 柞蚕溶菌酶基因密码子的优化 | 第24-25页 |
| 2.3.2 柞蚕溶菌酶基因及表达载体的双酶切 | 第25页 |
| 2.3.3 双酶切产物的回收 | 第25-26页 |
| 2.3.4 柞蚕溶菌酶基因与pPIC9K载体连接 | 第26页 |
| 2.3.5 大肠杆菌DH5α感受态的制备 | 第26-27页 |
| 2.3.6 连接产物的转化与双酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第28-30页 |
| 2.4.1 密码子优化后的柞蚕溶菌酶基因序列 | 第28-29页 |
| 2.4.2 pPIC9K-ApLZ表达载体的构建及双酶切鉴定 | 第29-30页 |
| 2.5 本章小结 | 第30-31页 |
| 3 柞蚕溶菌酶在毕赤酵母中的表达及条件优化 | 第31-45页 |
| 3.1 引言 | 第31页 |
| 3.2 实验试剂与器材 | 第31-34页 |
| 3.2.1 主要试剂与材料 | 第31-32页 |
| 3.2.2 主要实验仪器 | 第32页 |
| 3.2.3 主要溶液及配制方法 | 第32-34页 |
| 3.3 实验方法 | 第34-39页 |
| 3.3.1 pPIC9K-ApLZ质粒的线性化与纯化 | 第34页 |
| 3.3.2 毕赤酵母感受态的制备 | 第34-35页 |
| 3.3.3 pPIC9K-ApLZ质粒的电击转化 | 第35页 |
| 3.3.4 阳性高拷贝转化子的筛选及PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 3.3.5 柞蚕溶菌酶在发酵罐中的诱导表达 | 第36-37页 |
| 3.3.6 柞蚕溶菌酶在发酵罐中表达条件的优化 | 第37-38页 |
| 3.3.7 柞蚕溶菌酶的SDS-PAGE电泳 | 第38-39页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第39-44页 |
| 3.4.1 阳性高拷贝转化子的筛选及PCR鉴定 | 第39-41页 |
| 3.4.2 诱导时间对柞蚕溶菌酶酶活的影响 | 第41页 |
| 3.4.3 诱导温度对柞蚕溶菌酶酶活的影响 | 第41-42页 |
| 3.4.4 诱导培养基pH对柞蚕溶菌酶酶活的影响 | 第42-43页 |
| 3.4.5 甲醇浓度对柞蚕溶菌酶酶活的影响 | 第43页 |
| 3.4.6 柞蚕溶菌酶的SDS-PAGE电泳鉴定 | 第43-44页 |
| 3.5 本章小结 | 第44-45页 |
| 4 柞蚕溶菌酶的分离纯化与活性测定 | 第45-57页 |
| 4.1 引言 | 第45页 |
| 4.2 实验试剂与器材 | 第45-46页 |
| 4.2.1 主要试剂与材料 | 第45-46页 |
| 4.2.2 主要实验仪器 | 第46页 |
| 4.2.3 主要溶液及配制方法 | 第46页 |
| 4.3 实验方法 | 第46-50页 |
| 4.3.1 硫酸铵盐析沉淀与透析 | 第46-47页 |
| 4.3.2 镍柱亲和层析 | 第47页 |
| 4.3.3 真空冷冻干燥 | 第47-48页 |
| 4.3.4 柞蚕溶菌酶N-糖基化鉴定 | 第48页 |
| 4.3.5 BCA法柞蚕溶菌酶浓度的测定 | 第48-49页 |
| 4.3.6 柞蚕溶菌酶酶活的测定 | 第49页 |
| 4.3.7 柞蚕溶菌酶抗菌谱的测定 | 第49-50页 |
| 4.3.8 柞蚕溶菌酶酶学性质测定 | 第50页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第50-56页 |
| 4.4.1 镍柱亲和层析纯化柞蚕溶菌酶 | 第50-51页 |
| 4.4.2 柞蚕溶菌酶N-糖基化鉴定 | 第51-52页 |
| 4.4.3 柞蚕溶菌酶酶活的测定 | 第52-53页 |
| 4.4.4 柞蚕溶菌酶抗菌谱的测定 | 第53-54页 |
| 4.4.5 柞蚕溶菌酶最适酶活反应温度 | 第54-55页 |
| 4.4.6 柞蚕溶菌酶最时酶活反应pH | 第55-56页 |
| 4.5 本章小结 | 第56-57页 |
| 结论与展望 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-62页 |
| 附录A 优化前后柞蚕溶菌酶基因序列比较及氨基酸序列 | 第62-63页 |
| 附录B 毕赤酵母密码子使用频率表 | 第63-64页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
