| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| Abbreviations | 第11-12页 |
| CHAPTER I INTRODUCTION | 第12-21页 |
| 1.1 Verticillium dahliae | 第12-14页 |
| 1.1.1 Life cycle of Verticillium dahliae | 第13页 |
| 1.1.2 Host range of Verticillium dahliae | 第13页 |
| 1.1.3 Symptoms caused by Verticillium dahliae | 第13-14页 |
| 1.2 Transformation of Verticillium dahliae | 第14-17页 |
| 1.2.1 Biolistic transformation | 第14-15页 |
| 1.2.2 Electroporation | 第15页 |
| 1.2.3 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) | 第15-16页 |
| 1.2.4 PEG-mediated transformation | 第16-17页 |
| 1.3 Ferric reductase transmembrane component 3 precursor | 第17-18页 |
| 1.4 Aims and objectives of the study | 第18-21页 |
| CHAPTER II MATERIALS AND METHODS | 第21-40页 |
| 2.1 Fungal growth and spores’ collection | 第21页 |
| 2.2 Protoplast isolation | 第21页 |
| 2.3 Regeneration of protoplast | 第21-22页 |
| 2.4 GFP plasmid and siRNAs | 第22-23页 |
| 2.5 PEG-mediated transformation | 第23-24页 |
| 2.6 Electroporation | 第24页 |
| 2.7 siRNA inhibition assay for GFP and Vta2 genes | 第24-25页 |
| 2.8 RNA extraction | 第25-26页 |
| 2.9 First strand cDNA synthesis | 第26页 |
| 2.10 qRT-PCR analysis of Vta2 expression level | 第26-27页 |
| 2.11 Genomic DNA isolation | 第27-28页 |
| 2.12 Phylogenetic analysis of FreB | 第28-29页 |
| 2.13 Plasmid construction for mutants’ generation | 第29-35页 |
| 2.13.1 PCR amplification of the respective fragments and genes | 第29-30页 |
| 2.13.2 Gel purification of PCR products by Gel purification kit | 第30-31页 |
| 2.13.3 Cloning the purified PCR product into T-vector | 第31页 |
| 2.13.4 Transformation into Escherichia coli (heat shock method) | 第31页 |
| 2.13.5 Construction of gene knockout fragment | 第31-33页 |
| 2.13.6 Construction of GFP tagged plasmid | 第33页 |
| 2.13.7 Construction of plasmid for complementation | 第33-34页 |
| 2.13.8 Extraction of plasmid | 第34-35页 |
| 2.14 PEG-mediated protoplast transformation for mutants’ generation | 第35-36页 |
| 2.14.1 Generation of FreB knockout mutants (ΔFreB) | 第35页 |
| 2.14.2 Generation of GFP disruption mutants | 第35-36页 |
| 2.14.3 Generation of FreB complementary mutants (ΔFreB-C) | 第36页 |
| 2.15 Growth of ΔFreB on different carbon sources | 第36页 |
| 2.16 Analysis of growth on media with different iron sources | 第36-37页 |
| 2.17 Ferric reductase assay | 第37页 |
| 2.18 Oxidative stress assay | 第37页 |
| 2.19 Pathogenicity assay | 第37-38页 |
| 2.20 Disease index | 第38页 |
| 2.21 Expression analysis of related genes | 第38-39页 |
| 2.22 Composition of media and buffers | 第39-40页 |
| CHAPTER III Building an efficient transformation system for Verticillium dahliae | 第40-49页 |
| 3.1 Introduction | 第40-42页 |
| 3.2 Results | 第42-47页 |
| 3.2.1 Isolation of protoplasts | 第42-44页 |
| 3.2.2 Regeneration of protoplast | 第44-45页 |
| 3.2.3 Observation of fluorescence from GFP expression | 第45页 |
| 3.2.4 GFP transformants selection and stability of the transgene | 第45-46页 |
| 3.2.5 Silencing of GFP gene in Vd-GFP strain with siRNAs | 第46页 |
| 3.2.6 Silencing of Vta2 gene | 第46-47页 |
| 3.3 Conclusion | 第47-49页 |
| CHAPTER IV Plasmid construction for gene deletion and complementation | 第49-59页 |
| 4.1 Introduction | 第49-50页 |
| 4.2 Results | 第50-58页 |
| 4.2.1 Phylogenetic analysis | 第50页 |
| 4.2.2 Generation of FreB mutants | 第50-53页 |
| 4.2.3 Generation of GFP tagged mutants | 第53-56页 |
| 4.2.4 Generation of FreB complementary mutants | 第56-58页 |
| 4.3 Conclusion | 第58-59页 |
| CHAPTER V Analysis of ΔFreB mutants | 第59-70页 |
| 5.1 Introduction | 第59-60页 |
| 5.2 Results | 第60-68页 |
| 5.2.1 Carbon sources utilization assay | 第60-62页 |
| 5.2.2 Comparing the growth of mutants on different iron sources | 第62-64页 |
| 5.2.3 Deletion of FreB gene impaired the surface ferric reductase activity | 第64-65页 |
| 5.2.4 Disruption of FreB gene resulted in increased susceptibility to oxidative stress54 | 第65-66页 |
| 5.2.5 Deletion of FreB gene resulted in increased expression level of related genes..555.2.6 FreB deletion attenuates virulence of V. dahliae | 第66-67页 |
| 5.2.6 FreB deletion attenuates virulence of V. dahliae | 第67-68页 |
| 5.3 Conclusion | 第68-70页 |
| DISCUSSION | 第70-74页 |
| CONCLUSION | 第74-75页 |
| REFERENCES | 第75-84页 |
| ACKNOWLEDGEMENTS | 第84-85页 |
| CURRICULUM VITAE | 第85-86页 |
