| 摘要 | 第6-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 英文缩略词表 | 第12-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-31页 |
| 1.1 脑胶质瘤 | 第17-19页 |
| 1.1.1 脑胶质瘤的分类及特征 | 第17-18页 |
| 1.1.2 脑胶质瘤的常规治疗 | 第18-19页 |
| 1.1.3 脑胶质瘤的基因治疗 | 第19页 |
| 1.2 透明相关成蛋白 1 | 第19-21页 |
| 1.2.1 Diaph1的结构 | 第19-20页 |
| 1.2.2 Diaph1涉及的信号通路 | 第20-21页 |
| 1.3 肿瘤细胞侵袭与迁移 | 第21-23页 |
| 1.3.1 MMPs | 第21-22页 |
| 1.3.2 侵袭性伪足与ECM | 第22页 |
| 1.3.3 其他相关蛋白 | 第22-23页 |
| 1.4 RNA干扰 | 第23-26页 |
| 1.4.1 RNAi的发现 | 第23-24页 |
| 1.4.2 RNAi技术的分子机制 | 第24-25页 |
| 1.4.3 RNAi技术的应用 | 第25-26页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9基因敲除技术 | 第26-29页 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 | 第26页 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9的分子机制 | 第26-28页 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的应用与前景 | 第28-29页 |
| 1.6 生物信息学预测 | 第29-31页 |
| 1.6.1 String数据库 | 第29页 |
| 1.6.2 GO富集分析和KEGG通路分析 | 第29-31页 |
| 第二章 材料与方法 | 第31-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-33页 |
| 2.1.1 实验细胞与样本 | 第31页 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 | 第31-33页 |
| 2.2 仪器 | 第33-35页 |
| 2.3 实验方法 | 第35-55页 |
| 2.3.1 组织与细胞免疫染色 | 第35-38页 |
| 2.3.2 Diaph1 RNA干扰质粒构建、提取、纯化与鉴定 | 第38-42页 |
| 2.3.3 CRISPR/Cas9/gRNA-Diaph1基因敲除质粒的构建、提取、纯化与鉴定 | 第42-43页 |
| 2.3.4 脑胶质瘤细胞系U87和U251的体外培养与转染 | 第43-44页 |
| 2.3.5 细胞免疫荧光染色 | 第44-45页 |
| 2.3.6 细胞增殖检测实验 | 第45页 |
| 2.3.7 细胞凋亡检测实验 | 第45页 |
| 2.3.8 细胞迁移能力检测实验 | 第45-46页 |
| 2.3.9 荧光实时定量PCR | 第46-48页 |
| 2.3.10 Western Blot | 第48-50页 |
| 2.3.11 免疫共沉淀 | 第50-51页 |
| 2.3.12 明胶酶谱 | 第51-52页 |
| 2.3.13 溶液的配制 | 第52-55页 |
| 2.4 生物信息学预测 | 第55页 |
| 2.5 数据分析与统计 | 第55-56页 |
| 第三章 实验结果 | 第56-94页 |
| 3.1 Diaph1在脑胶质瘤组织中的表达与分布 | 第56-57页 |
| 3.1.1 Diaph1在脑胶质瘤组织中过表达 | 第56-57页 |
| 3.1.2 Diaph1在恶性脑胶质瘤组织中的表达与分布 | 第57页 |
| 3.2 Diaph1在脑胶质瘤细胞系U87和U251中的表达与分布 | 第57-58页 |
| 3.3 Diaph1 RNA干扰质粒的转染及干扰效率鉴定 | 第58-62页 |
| 3.3.1 Diaph1 RNA干扰质粒的转染 | 第58-59页 |
| 3.3.2 采用荧光实时定量PCR检测Diaph1 RNA干扰质粒的干扰效率 | 第59-61页 |
| 3.3.3 采用Western blot分析Diaph1 RNA干扰质粒的干扰效率 | 第61-62页 |
| 3.4 下调Diaph1表达抑制脑胶质瘤细胞的增殖能力 | 第62-66页 |
| 3.5 下调Diaph1表达能够诱导脑胶质瘤细胞凋亡 | 第66-68页 |
| 3.6 下调Diaph1表达能够抑制脑胶质瘤细胞的迁移能力 | 第68-73页 |
| 3.7 下调Diaph1表达对MMP2、MMP9的表达与活性的影响 | 第73-80页 |
| 3.7.1 MMP2、MMP9在脑胶质瘤细胞系U87和U251中的表达与分布 | 第73-75页 |
| 3.7.2 采用荧光实时定量PCR检测下调Diaph1表达对MMP2、MMP9 mRNA的影响 | 第75-77页 |
| 3.7.3 采用Western blot分析下调Diaph1表达对胞内MMP2、MMP9蛋白表达的影响 | 第77-78页 |
| 3.7.4 采用明胶酶谱法检测下调Diaph1表达对胞外MMP2、MMP9蛋白活性的影响 | 第78-80页 |
| 3.8 CRISPR/Cas9/gRNA-Diaph1敲除质粒的构建、转染和敲除效率检测 | 第80-82页 |
| 3.8.1 CRISPR/ Cas9/gRNA-Diaph1敲除质粒的构建 | 第80页 |
| 3.8.2 CRISPR/Cas9/gRNA-Diaph1敲除质粒的转染 | 第80-81页 |
| 3.8.3 采用Western Blot分析CRISPR/Cas9/gRNA-Diaph1敲除质粒的敲除效率 | 第81-82页 |
| 3.9 采用Western blot分析敲除Diaph1基因对细胞中相关蛋白表达的影响 | 第82-83页 |
| 3.10 脑胶质瘤细胞中内源性Diaph1与相关蛋白的共定位 | 第83-88页 |
| 3.11 脑胶质瘤细胞中内源性Diaph1与相关蛋白的相互作用 | 第88-90页 |
| 3.12 生物信息学预测 | 第90-94页 |
| 3.12.1 构建Diaph1蛋白互作网络 | 第90-92页 |
| 3.12.2 基因的GO富集分析和KEGG通路富集分析 | 第92-94页 |
| 第四章 讨论 | 第94-102页 |
| 第五章 结论 | 第102-103页 |
| 附录 | 第103-111页 |
| 附录Ⅰ：homo Diaph1基因全长序列 | 第103-107页 |
| 附录Ⅱ：pGPU6-GFP-Neo siRNA质粒图谱 | 第107-108页 |
| 附录Ⅲ：pGPU6-Diaph1的测序结果 | 第108-109页 |
| 附录Ⅳ：pCAG-T7-cas9+gRNA-pgk-Puro-T2A-GFP质粒图谱 | 第109-110页 |
| 附录Ⅴ：CRISPR/Cas9/gRNA-Diaph1基因敲除质粒测序结果 | 第110-111页 |
| 参考文献 | 第111-130页 |
| 作者在攻读博士学位期间公开发表的论文 | 第130-131页 |
| 作者在攻读博士学位期间参加的项目 | 第131-132页 |
| 致谢 | 第132-134页 |
