| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 常用英文缩略词表 | 第11-13页 |
| 第一章 综述及研究目的与意义 | 第13-24页 |
| 1 文献综述 | 第13-22页 |
| ·研究概况 | 第13页 |
| ·CRISPR/Cas系统的发展历史 | 第13-14页 |
| ·CRISPR/Cas系统的组织结构 | 第14-15页 |
| ·CRISPR/Cas系统的分类 | 第15-16页 |
| ·CRISPR/Cas系统的免疫机理 | 第16-19页 |
| ·CRISPR/Cas系统的应用历程 | 第19-21页 |
| ·CRISPR/Cas9系统脱靶效应 | 第21-22页 |
| ·aroA基因的研究进展 | 第22页 |
| 2 本研究的目的和意义 | 第22-24页 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用 | 第24-50页 |
| 1 材料 | 第24-27页 |
| ·菌株和质粒 | 第24-26页 |
| ·主要试剂 | 第26-27页 |
| ·主要实验仪器设备 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-38页 |
| ·sgRNA的设计和相关引物的合成 | 第27-28页 |
| ·sgRNA载体的构建 | 第28-34页 |
| ·sgRNA的退火连接 | 第28-29页 |
| ·psgRNA-GFP质粒的酶切 | 第29页 |
| ·酶切质粒的纯化回收 | 第29-30页 |
| ·连接反应 | 第30-31页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·转化 | 第32页 |
| ·阳性克隆菌的筛选 | 第32-33页 |
| ·重组质粒的PCR鉴定、序列测定 | 第33-34页 |
| ·aroA基因同源臂(Donor)载体的构建 | 第34-37页 |
| ·大肠杆菌DH10B基因组DNA的提取 | 第34-35页 |
| ·aroA基因同源臂的PCR扩增 | 第35-36页 |
| ·目的基因和质粒的酶切 | 第36页 |
| ·目的基因的连接与转化 | 第36页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第36页 |
| ·完整aroA基因Donor载体的构建与鉴定 | 第36-37页 |
| ·含sgRNA及aroA基因同源臂载体的构建 | 第37页 |
| ·DH5α、DH10B、JM109菌株aroA基因的敲除及筛选 | 第37-38页 |
| ·分步转化 | 第37页 |
| ·PCR及克隆鉴定 | 第37-38页 |
| ·基因缺失菌生长曲线的测定 | 第38页 |
| 3 结果 | 第38-47页 |
| ·sgRNA的设计 | 第38-39页 |
| ·sgRNA载体构建结果 | 第39-41页 |
| ·aroA基因同源臂载体的构建结果 | 第41-43页 |
| ·psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor载体构建结果 | 第43-45页 |
| ·对不同大肠杆菌aroA基因敲除效率的检测结果 | 第45-46页 |
| ·基因缺失菌生长曲线的测定结果 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-50页 |
| 第三章 结论 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-61页 |
| 附录 | 第61-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
