| 目录 | 第1-6页 |
| 图表目录 | 第6-7页 |
| 中文摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 英文略语表 | 第9-11页 |
| 前言 | 第11-13页 |
| 第一部分 H5N1血凝素蛋白H5基因的质粒构建 | 第13-30页 |
| 1 实验材料 | 第13-17页 |
| ·质粒 | 第13页 |
| ·菌株 | 第13页 |
| ·工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker | 第13页 |
| ·主要化学试剂 | 第13-14页 |
| ·试剂盒 | 第14页 |
| ·主要仪器及设备 | 第14-15页 |
| ·主要溶液配方 | 第15-17页 |
| ·E.coli用培养基的配制 | 第15页 |
| ·制备感受态细胞相关溶液 | 第15页 |
| ·抗生素的配制 | 第15-16页 |
| ·大量提取质粒DNA的相关溶液 | 第16页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制 | 第16页 |
| ·常用缓冲液的配制 | 第16-17页 |
| ·PCR引物 | 第17页 |
| 2 实验方法 | 第17-24页 |
| ·单链复性 | 第17页 |
| ·PCR扩增 | 第17-18页 |
| ·酶切消化 | 第18页 |
| ·连接 | 第18-19页 |
| ·转化 | 第19页 |
| ·鉴定 | 第19-20页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第20页 |
| ·质粒DNA的小提 | 第20-21页 |
| ·Western blotting的检测方法 | 第21-22页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第22-24页 |
| ·重组质粒DNA浓度的测定 | 第24页 |
| 3 实验结果 | 第24-30页 |
| ·优化H5蛋白,并合成H5蛋白基因 | 第24-25页 |
| ·构建克隆,并检测 | 第25-26页 |
| ·瞬时转染质粒Peak13 CD5L H5 TEV hFc,检测表达量 | 第26页 |
| ·扩增去跨膜端△TM H5蛋白基因 | 第26-28页 |
| ·瞬时转染细胞,检测蛋白的表达 | 第28页 |
| ·质粒大提 | 第28-30页 |
| 第二部分 构建稳定表达H5融合蛋白的细胞株 | 第30-39页 |
| 1 实验材料 | 第30-32页 |
| ·细胞培养基及血清 | 第30页 |
| ·试剂 | 第30页 |
| ·细胞培养耗材 | 第30页 |
| ·仪器及设备 | 第30-31页 |
| ·细胞冻存液的配制 | 第31页 |
| ·细胞裂解液的配制 | 第31页 |
| ·蛋白质电泳及检测缓冲液 | 第31页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-36页 |
| ·DNA的纯化回收 | 第32页 |
| ·贴壁细胞培养 | 第32页 |
| ·稳定表达细胞株的构建 | 第32-33页 |
| ·细胞冻存 | 第33页 |
| ·细胞复苏 | 第33页 |
| ·细胞裂解 | 第33-34页 |
| ·Western blotting的检测方法 | 第34-35页 |
| ·ELISA检测方法 | 第35-36页 |
| 3 实验结果 | 第36-39页 |
| ·质粒线性化并回收线性化的DNA | 第36页 |
| ·将线性化的质粒转染细胞,构建稳定表达细胞株 | 第36-37页 |
| ·检测融合蛋白的正确表达,并测定表达量 | 第37-39页 |
| 第三部分 H5融合蛋白的纯化和生物活性检测 | 第39-44页 |
| 1 实验材料 | 第39页 |
| ·试剂与耗材 | 第39页 |
| ·主要仪器与设备 | 第39页 |
| 2 实验方法 | 第39-41页 |
| ·蛋白纯化 | 第39-40页 |
| ·用流式细胞技术检测表达蛋白的活性 | 第40-41页 |
| 3 实验结果 | 第41-44页 |
| ·蛋白提纯 | 第41页 |
| ·融合蛋白的活性检测 | 第41-44页 |
| ·用MEF细胞检测融合蛋白的活性 | 第41-42页 |
| ·用HeLa细胞检测融合蛋白的活性 | 第42-44页 |
| 讨论 | 第44-49页 |
| 小结 | 第49-51页 |
| 参考文献 | 第51-53页 |
| 综述 | 第53-63页 |
| 简历 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64页 |