| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一部分 前言 | 第9-24页 |
| 综述 | 第11页 |
| 1 番鸭呼肠孤病毒病的研究进展 | 第11-16页 |
| ·禽(番鸭)呼肠孤病毒简介 | 第11页 |
| ·番鸭呼肠孤病毒基因组特征与功能 | 第11-13页 |
| ·病原学特征 | 第13-14页 |
| ·流行病学 | 第14页 |
| ·临床特征 | 第14-15页 |
| ·病理变化 | 第15页 |
| ·致病机理 | 第15-16页 |
| ·诊断与防制 | 第16页 |
| 2 巴斯德毕赤酵母真核表达系统简介 | 第16-24页 |
| ·生物学特性 | 第17页 |
| ·毕赤酵母表型 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母表达载体及其元件 | 第18-20页 |
| ·毕赤酵母表达载体的整合 | 第20页 |
| ·P.Pastoris表达系统的优点 | 第20-21页 |
| ·影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达的因素及优化策略 | 第21-24页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第24-39页 |
| 1 材料 | 第24-29页 |
| ·病毒 | 第24页 |
| ·实验动物 | 第24页 |
| ·菌株、质粒和抗生素 | 第24页 |
| ·抗体 | 第24页 |
| ·主要试剂 | 第24-25页 |
| ·引物 | 第25页 |
| ·溶液配制 | 第25-28页 |
| ·毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制 | 第28页 |
| ·主要仪器 | 第28-29页 |
| 2 方法 | 第29-39页 |
| ·病毒培养增殖 | 第29页 |
| ·番鸭呼肠孤病毒RNA的提取 | 第29页 |
| ·番鸭呼肠孤病毒σC片段的扩增(RT—PCR) | 第29-30页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| ·回收番鸭呼肠孤病毒σC片段(PCR产物)和连接pMD18-T载体 | 第31页 |
| ·质粒转化 | 第31-32页 |
| ·重组质粒DNA(pMD18-T-σC)的提取与PCR、酶切验证 | 第32-33页 |
| ·测序 | 第33页 |
| ·限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ对空载体pPIC9K和pMD18-T-σC片段进行双酶切 | 第33-34页 |
| ·表达载体pPIC9K和σC片段的连接 | 第34页 |
| ·把连接产物转化到感受态细胞DH5α | 第34页 |
| ·酵母GS115感受肽的制备 | 第34页 |
| ·重组质粒pPIC9K-σC转化酵母 | 第34-35页 |
| ·GS115酵母基因组的提取 | 第35-36页 |
| ·重组表达载体酵母基因组的PCR鉴定 | 第36页 |
| ·拷贝数筛选 | 第36页 |
| ·酵母诱导表达 | 第36-37页 |
| ·免疫印记Western-Blot | 第37页 |
| ·σC蛋白抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法的初步建立 | 第37-39页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第39-48页 |
| 1 RT-PCR扩增和pMD18-T-σC酶切鉴定 | 第39页 |
| 2 测序结果和核苷酸序列分析 | 第39-40页 |
| 3 σC基因推导的氨基酸序列的二级结构预测 | 第40-41页 |
| 4 重组表达质粒pPIC9K-σC构建结果 | 第41-43页 |
| 5 重组表达质粒pPIC9K-σC电转化酵母GS115及筛选结果 | 第43页 |
| 6 酵母诱导表达结果 | 第43-45页 |
| 7 免疫印记Western-Blot结果 | 第45页 |
| 8 σC蛋白抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果 | 第45-47页 |
| 9 间接ELISA的特异性试验结果 | 第47-48页 |
| 第四部分 结果讨论 | 第48-52页 |
| 1 番鸭呼肠孤病毒的分类意义 | 第48页 |
| 2 酵母表达与原核表达的优势和区别 | 第48-49页 |
| 3 毕赤酵母表达密码子的偏爱 | 第49页 |
| 4 σC蛋白毕赤酵母高效表达转化子的筛选 | 第49-50页 |
| 5 蛋白酶对巴斯德毕赤酵母表达的影响 | 第50-51页 |
| 6 Western Blot检测分析 | 第51页 |
| 7 ELISA检测分析 | 第51-52页 |
| 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献: | 第53-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
