| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-47页 |
| 1 甘露聚糖酶简介 | 第14-25页 |
| ·甘露聚糖酶来源和种类 | 第14页 |
| ·甘露聚糖酶的结构特征 | 第14-17页 |
| ·甘露聚糖酶的多样性 | 第17-20页 |
| ·甘露聚糖酶的多样性表现 | 第17-18页 |
| ·甘露聚糖酶多样性的分析 | 第18-20页 |
| ·甘露聚糖酶的生理功能 | 第20-21页 |
| ·甘露聚糖酶的研究概况 | 第21-25页 |
| 2 芽孢杆菌表达体系的简介 | 第25-28页 |
| 3 蛋白质体外改造及其技术 | 第28-43页 |
| ·蛋白质的理性设计 | 第29-30页 |
| ·蛋白质的非理性设计 | 第30-41页 |
| ·易错PCR技术 | 第31页 |
| ·DNA shuffling | 第31-33页 |
| ·DNA家族改组 | 第33页 |
| ·StEP重组 | 第33-34页 |
| ·部分基因片段改组 | 第34页 |
| ·单链DNA家族改组 | 第34页 |
| ·简并引物基因改组 | 第34-35页 |
| ·基因组改组 | 第35页 |
| ·随机引物体外重组法 | 第35页 |
| ·过渡模板随机嵌合生长 | 第35-36页 |
| ·酵母增强组合文库 | 第36-37页 |
| ·渐增切割法产生杂和酶 | 第37-38页 |
| ·不依赖序列同源性的蛋白质重组 | 第38页 |
| ·其他分子进化的方法 | 第38-40页 |
| ·突变库筛选策略 | 第40-41页 |
| ·蛋白质的半合理设计 | 第41-43页 |
| ·基于结构的有选择的随机突变 | 第41-42页 |
| ·随机突变后的定点饱和突变 | 第42页 |
| ·随机突变与定点饱和突变同步 | 第42页 |
| ·计算机辅助的半合理设计 | 第42-43页 |
| 4 酶制剂的稳定性 | 第43-47页 |
| 第二章 甘露聚糖酶的基因表达体系优化及其酶学表征 | 第47-70页 |
| 1 试验材料 | 第47-50页 |
| ·仪器 | 第47-48页 |
| ·主要试剂 | 第48页 |
| ·菌种和质粒 | 第48-49页 |
| ·溶液配置 | 第49-50页 |
| 2 方法 | 第50-59页 |
| ·细菌总DNA的提取 | 第50页 |
| ·质粒的制备 | 第50-51页 |
| ·目的基因的克隆 | 第51页 |
| ·PCR产物的电泳检测 | 第51-52页 |
| ·PCR产物的纯化和回收 | 第52页 |
| ·PCR产物的酶切 | 第52页 |
| ·质粒pHY-p43的酶切、产物纯化及去磷酸化处理 | 第52-53页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第53页 |
| ·重组质粒pHY-p43-man23的构建和转化 | 第53-54页 |
| ·重组质粒pHY-p43-man23的构建 | 第53-54页 |
| ·重组质粒的转化 | 第54页 |
| ·重组质粒pBPS-man23的构建和转化 | 第54-55页 |
| ·Brevibacillus brevis细胞壁蛋白基因的启动子和信号肽的分析和克隆 | 第54页 |
| ·质粒pKF34的构建 | 第54-55页 |
| ·重组基因pBPS-man23的构建及其转化 | 第55页 |
| ·酶的分离纯化 | 第55-56页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第56-57页 |
| ·蛋白质标准曲线的制作 | 第56-57页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第57页 |
| ·酶活力的测定 | 第57-58页 |
| ·甘露糖标准曲线的制作 | 第57页 |
| ·甘露聚糖酶活力的测定 | 第57-58页 |
| ·表达产物的电泳检测 | 第58-59页 |
| 3 结果 | 第59-68页 |
| ·重组基因pHY-p43-man23的获得 | 第59-62页 |
| ·甘露聚糖酶Man23全基因的克隆 | 第59-60页 |
| ·质粒pHY-p43的制备和鉴定 | 第60页 |
| ·基因man23和质粒pHY-p43的酶切及鉴定 | 第60-61页 |
| ·酶切产物的连接及重组子的转化 | 第61-62页 |
| ·重组表达质粒宿主菌的优化 | 第62-64页 |
| ·man23基因启动子的确定 | 第64-65页 |
| ·短短芽胞杆菌细胞壁蛋白基因的启动子和信号肽编码序列的获得 | 第64-65页 |
| ·重组基因pBPS-man23在短短芽胞杆菌中的分泌表达 | 第65页 |
| ·重组酶的纯化及酶学性质 | 第65-68页 |
| ·重组酶的反应温度 | 第65-66页 |
| ·重组酶的反应pH范围 | 第66-67页 |
| ·重组酶的反应动力学 | 第67-68页 |
| 4 讨论 | 第68-70页 |
| ·外源基因表达系统宿主菌的选择 | 第68页 |
| ·芽孢杆菌体系中表达载体的选择 | 第68-70页 |
| 第三章 甘露聚糖酶Man23活性中心的鉴定及其催化效率的优化 | 第70-91页 |
| 1 材料与方法 | 第71-77页 |
| ·材料 | 第71-72页 |
| ·菌种和质粒 | 第71页 |
| ·试剂 | 第71页 |
| ·生物学分析软件和数据库 | 第71页 |
| ·仪器 | 第71-72页 |
| ·方法 | 第72-77页 |
| ·酶的制备 | 第72页 |
| ·酶的化学修饰 | 第72页 |
| ·二硫键的测定 | 第72-73页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第73页 |
| ·催化活力的测定 | 第73页 |
| ·酶与底物结合的荧光光谱测定 | 第73页 |
| ·吲哚基与羧基修饰作用动力学参数测定 | 第73页 |
| ·催化反应的米氏常数测定 | 第73-74页 |
| ·酶Man23分子结构的计算机辅助分析 | 第74页 |
| ·基因man23在大肠杆菌中的转化 | 第74-75页 |
| ·定点突变库的建立及筛选 | 第75-77页 |
| 2 结果 | 第77-89页 |
| ·甘露聚糖酶Man23的活性相关基因 | 第77-82页 |
| ·巯基修饰剂对酶活力的影响 | 第77-78页 |
| ·羧基修饰剂对酶活力的影响 | 第78-79页 |
| ·吲哚基修饰剂对酶活力的影响 | 第79-81页 |
| ·其他修饰剂对酶活力的影响 | 第81-82页 |
| ·基于结构信息学的计算机辅助分析 | 第82-86页 |
| ·甘露聚糖酶Man23活性相关的特定位点 | 第86-88页 |
| ·甘露聚糖酶Man23特定位点的饱和突变 | 第88-89页 |
| 3 讨论 | 第89-91页 |
| ·半合理设计思路在鉴定酶的活性中心中的运用 | 第89-90页 |
| ·甘露聚糖酶Man23活性中心的分子基础 | 第90-91页 |
| 第四章 甘露聚糖酶的稳定性研究 | 第91-112页 |
| 1 材料与方法 | 第92-94页 |
| ·菌种和质粒 | 第92页 |
| ·试剂 | 第92页 |
| ·仪器 | 第92页 |
| ·计算机辅助设计方法 | 第92-93页 |
| ·突变库的构建方法 | 第93页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第93页 |
| ·酶活力的测定 | 第93页 |
| ·催化动力学的测定 | 第93页 |
| ·酶的纯化和SDS-PAGE的方法 | 第93页 |
| ·酶稳定性的评价 | 第93-94页 |
| ·稳定剂对酶Man23耐热性的影响 | 第93-94页 |
| ·稳定剂对酶Man23保存期的影响 | 第94页 |
| ·复合稳定剂中组分及其比例的正交试验 | 第94页 |
| 2 结果 | 第94-110页 |
| ·基于非共价键形成的定点突变 | 第94-95页 |
| ·基于分子表面电荷分布的定点突变 | 第95-96页 |
| ·基于立体键角合理化的定点突变 | 第96-98页 |
| ·最终突变体M0710的获得 | 第98-99页 |
| ·突变酶M0710的纯化及酶学性质的表征 | 第99页 |
| ·单一稳定剂对甘露聚糖酶M0710稳定性的影响 | 第99-105页 |
| ·多元醇类作为稳定剂对酶的影响 | 第99-101页 |
| ·防腐剂作为稳定剂对酶的影响 | 第101-103页 |
| ·金属离子作为稳定剂对酶的影响 | 第103-104页 |
| ·糖类作为稳定剂对酶的影响 | 第104-105页 |
| ·复合稳定剂对甘露聚糖酶Ma0710稳定性的影响 | 第105-110页 |
| ·同类稳定剂协同作用对酶稳定性的影响 | 第105-107页 |
| ·不同类型稳定剂协同作用对酶稳定性的影响 | 第107页 |
| ·复合稳定剂最佳添加量的配比 | 第107-108页 |
| ·复合稳定剂的长效试验 | 第108-110页 |
| 3 讨论 | 第110-112页 |
| ·酶耐热性的分子基础 | 第110-111页 |
| ·酶耐热性的微环境 | 第111-112页 |
| 第五章 研究结论和创新点 | 第112-114页 |
| 1 研究结论 | 第112-113页 |
| 2 创新点 | 第113-114页 |
| 参考文献 | 第114-128页 |
| 作者简历 | 第128页 |
| 在读期间发表文章 | 第128-129页 |
| 在读期间参与课题 | 第129页 |
| 博士在读期间获奖情况 | 第129-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
