| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 一、前言 | 第10-20页 |
| 1.nm23-H1基因 | 第10-13页 |
| ·nm23-H1基因的结构 | 第10页 |
| ·nm23-H1基因的功能 | 第10-11页 |
| ·nm23-H1基因与恶性血液病的相关性 | 第11-13页 |
| 2.RNA干扰及其在恶性血液病研究中的应用 | 第13-16页 |
| ·RNA干扰的作用机制 | 第13-14页 |
| ·RNA干扰在恶性血液病研究中的应用 | 第14-16页 |
| 3.白血病的研究 | 第16-17页 |
| 4.研究目的和意义 | 第17-18页 |
| ·研究目的 | 第17页 |
| ·研究意义 | 第17-18页 |
| 5.研究创新点 | 第18页 |
| 6.研究内容及技术路线 | 第18-20页 |
| 二、实验材料与方法 | 第20-33页 |
| 1.实验材料 | 第20-24页 |
| ·载体、菌株与细胞 | 第20页 |
| ·试剂盒 | 第20页 |
| ·工具酶和分子量标准 | 第20-21页 |
| ·主要试剂 | 第21页 |
| ·引物 | 第21-22页 |
| ·试剂配制 | 第22-23页 |
| ·主要仪器 | 第23-24页 |
| 2.实验方法 | 第24-33页 |
| ·细胞培养 | 第24页 |
| ·pSilencer~(TM) 4.1-CMV-siRNA的制备和鉴定 | 第24-25页 |
| ·pSilencer~(TM) 4.1-CMV-siRNA沉默效果鉴定 | 第25-28页 |
| ·稳定沉默细胞模型的建立和鉴定 | 第28-30页 |
| ·细胞形态学及细胞结构的观察 | 第30-31页 |
| ·MTT法绘制细胞生长曲线 | 第31页 |
| ·流式细胞术检测细胞周期 | 第31页 |
| ·NBT还原比色实验检测细胞分化功能 | 第31页 |
| ·流式细胞术检测细胞分化表面抗原的表达 | 第31-32页 |
| ·Real-time PCR检测分化相关基因c-myc的表达变化 | 第32页 |
| ·数据处理 | 第32-33页 |
| 三、实验结果 | 第33-46页 |
| 1.干扰质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| ·双酶切鉴定 | 第33页 |
| ·测序结果 | 第33-34页 |
| 2.转染体系的确定 | 第34页 |
| ·转染pEGFP-N1质粒的K562细胞中报告基因GFP的表达情况 | 第34页 |
| ·RNA干扰质粒转染系统的有效性检测 | 第34页 |
| 3.细胞模型的建立 | 第34-36页 |
| ·K562细胞的G418敏感浓度确定 | 第34-35页 |
| ·筛选阳性克隆细胞 | 第35-36页 |
| 4.细胞模型的鉴定 | 第36-38页 |
| ·筛选得到的阳性细胞的基因组DNA检测 | 第36页 |
| ·Real-time PCR检测nm23-H1基因mRNA表达水平的变化 | 第36-38页 |
| ·免疫细胞化学检测nm23-H1基因蛋白质表达水平的变化 | 第38页 |
| 5.细胞形态学及细胞结构的观察 | 第38-40页 |
| ·普通光镜下观察各组细胞的形态变化 | 第38-40页 |
| ·吉姆萨—瑞氏染色观察细胞结构的变化 | 第40页 |
| 6.细胞生长曲线 | 第40页 |
| 7.细胞周期变化 | 第40-42页 |
| 8.NBT比色还原反应 | 第42页 |
| 9.细胞表面抗原的检测 | 第42-44页 |
| 10.检测nm23-H1基因与c-myc基因表达的关系 | 第44-46页 |
| 四、讨论 | 第46-56页 |
| 1.K562细胞的生物学特性 | 第46页 |
| 2.获取siRNA方法的选择 | 第46-48页 |
| ·化学合成法 | 第46-47页 |
| ·体外转录合成法 | 第47页 |
| ·siRNA表达框架在细胞中表达siRNA | 第47页 |
| ·siRNA表达载体在细胞中表达siRNA | 第47-48页 |
| 3.RNA干扰的有效性检测 | 第48-50页 |
| 4.稳定表达shRNA细胞模型的鉴定 | 第50页 |
| 5.沉默nm23-H1基因对细胞的增殖和周期的影响 | 第50-51页 |
| 6.nm23-H1基因对细胞分化的影响 | 第51-52页 |
| 7.nm23-H1基因与c-myc基因的关系 | 第52-53页 |
| 8.nm23-H1基因与细胞分化的关系和作用机制 | 第53-56页 |
| ·细胞周期与分化的关系 | 第53-54页 |
| ·分化相关基因参与调控细胞分化 | 第54-55页 |
| ·信号转导通路与细胞分化的关系 | 第55页 |
| ·DNA复制与细胞分化方向的选择 | 第55-56页 |
| 五、结论与展望 | 第56-57页 |
| 1.结论 | 第56页 |
| 2.展望 | 第56-57页 |
| 六、附录 | 第57-60页 |
| 附录1 pSilencer~(TM) 4.1-CMV neo Vector Map | 第57-58页 |
| 附录2 pSilencer~(TM) 4.1-CMV-siNM526测序报告图 | 第58-59页 |
| 附录3 pSilencer~(TM) 4.1-CMV-siNM526基本信息 | 第59页 |
| 附录4 课题经费资助 | 第59-60页 |
| 七、参考文献 | 第60-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
