| 目录 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 缩略词 | 第10-12页 |
| 一 研究概况 | 第12-18页 |
| 1． 细胞分离素及P_(SAG12)-IPT基因的研究进展 | 第12-14页 |
| 1．1 植物衰老及细胞分裂素 | 第12-13页 |
| 1．2 P_(SAG12)-IPT基因研究进展 | 第13-14页 |
| 2． 蓝猪耳组织培养和遗传转化研究进展 | 第14-16页 |
| 2．1 蓝猪耳简介 | 第14-15页 |
| 2．2 蓝猪耳组织培养研究概况 | 第15页 |
| 2．3 蓝猪耳遗传转化研究进展 | 第15-16页 |
| 3． 根癌农杆菌介导转化的特点 | 第16-17页 |
| 3．1 根癌农杆菌介导基因转化的机理 | 第16页 |
| 3．2 根癌农杆菌介导基因转化的优点 | 第16-17页 |
| 4． 本研究的目的及意义 | 第17-18页 |
| 二 SAG12-IPT基因植物表达载体的构建及工程菌种的制备 | 第18-27页 |
| 1． 实验材料 | 第18-19页 |
| 1．1 载体及菌株 | 第18页 |
| 1．2 主要试剂 | 第18-19页 |
| 1．3 培养基 | 第19页 |
| 2． 实验方法 | 第19-24页 |
| 2．1 质粒酶切 | 第19页 |
| 2．2 酶切产物的纯化 | 第19-20页 |
| 2．3 载体与目的基因的连接 | 第20页 |
| 2．4 大肠杆菌感受态的制备 | 第20-21页 |
| 2．5 连接产物转化 | 第21页 |
| 2．6 质粒的提取 | 第21-22页 |
| 2．6．1 提取缓冲液 | 第21页 |
| 2．6．2 提取步骤 | 第21-22页 |
| 2．7 载体的酶切检测 | 第22页 |
| 2．8 载体构建流程图 | 第22页 |
| 2．9 根癌农杆菌 EHA101感受态的制备 | 第22-23页 |
| 2．10 冻融法将载体pHQIPT转化根癌农杆菌 EHA101 | 第23-24页 |
| 2．11 PCR检测工程菌 | 第24页 |
| 2．11．1 菌液处理 | 第24页 |
| 2．11．2 引物设计 | 第24页 |
| 2．11．3 PCR反应体系及反应程序 | 第24页 |
| 3． 结果与分析 | 第24-26页 |
| 3．1 SAG12-IPT基因植物表达载体的构建 | 第24-25页 |
| 3．2 工程菌种的制备 | 第25-26页 |
| 4． 讨论 | 第26-27页 |
| 三 根癌农杆菌介导 SAG12-IPT转化蓝猪耳及转基因植株的检测 | 第27-44页 |
| 1． 实验材料 | 第27-28页 |
| 1．1 植物材料及菌株 | 第27页 |
| 1．2 培养基 | 第27页 |
| 1．3 试剂及试剂盒 | 第27-28页 |
| 2． 实验方法 | 第28-37页 |
| 2．1 农杆菌的活化与外植体的侵染 | 第28页 |
| 2．2 GUS基因表达检测 | 第28-29页 |
| 2．3 丛生芽的抗性筛选 | 第29页 |
| 2．4 转基因株的 PCR检测 | 第29-30页 |
| 2．4．1 引物设计 | 第29页 |
| 2．4．2 PCR反应体系及反应程序 | 第29页 |
| 2．4．3 总 DNA的提取 | 第29-30页 |
| 2．4．3．1 提取用溶液 | 第29-30页 |
| 2．4．3．2 提取步骤 | 第30页 |
| 2．5 Southern blot | 第30-34页 |
| 2．5．1 总 DNA的提取 | 第30页 |
| 2．5．2 总 DNA酶切 | 第30-31页 |
| 2．5．3 探针制备 | 第31页 |
| 2．5．3．1 引物设计 | 第31页 |
| 2．5．3．2 反应体系及反应程序 | 第31页 |
| 2．5．4 总 DNA酶切样品转移到硝酸纤维素膜上 | 第31-34页 |
| 2．5．4．1 转移缓冲液 | 第31-32页 |
| 2．5．4．2 总DNA酶切产物电泳分离 | 第32页 |
| 2．5．4．3 转移 | 第32-33页 |
| 2．5．4．4 杂交 | 第33页 |
| 2．5．4．5 杂交后处理 | 第33-34页 |
| 2．5．4．6 显影和定影 | 第34页 |
| 2．6 Northern blot | 第34-37页 |
| 2．6．1 总 RNA提取 | 第34-35页 |
| 2．6．1．1 器皿和试剂 | 第34页 |
| 2．6．1．2 提取方法 | 第34-35页 |
| 2．6．2 探针制备 | 第35-36页 |
| 2．6．2．1 引物设计 | 第35页 |
| 2．6．2．2 反应体系及反应程序 | 第35-36页 |
| 2．6．3 总 RNA样品转移至硝酸纤维素膜上 | 第36-37页 |
| 2．6．3．1 转移缓冲液 | 第36页 |
| 2．6．3．2 RNA样品的变性处理 | 第36-37页 |
| 3．6．3．3 RNA的甲醛凝胶变性电泳 | 第37页 |
| 3．6．3．4 转膜 | 第37页 |
| 3． 结果与分析 | 第37-42页 |
| 3．1 根癌农杆菌介导SAG12-LPT转化蓝猪耳 | 第37-39页 |
| 3．1．1 GUS基因的瞬时表达检测 | 第37-39页 |
| 3．1．2 丛生芽的抗性筛选 | 第39页 |
| 3．2 转基因植株的获得及检测 | 第39-40页 |
| 3．2．1 转基因植株的获得 | 第39-40页 |
| 3．2．2 转基因植株的检测 | 第40-42页 |
| 3．2．2．1 GUS基因表达检测 | 第40页 |
| 3．2．2．2 PCR检测 | 第40-41页 |
| 3．2．2．3 Southem blot | 第41-42页 |
| 3．2．2．4 Northem blot | 第42页 |
| 4． 讨论 | 第42-44页 |
| 参考文献 | 第44-49页 |
| 附录 | 第49-50页 |
| 致谢 | 第50-52页 |
