| 摘要 | 第1-16页 |
| 前言 | 第16-36页 |
| 第一章 耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI的发现 | 第36-47页 |
| 1.引言 | 第36页 |
| 2.材料与方法 | 第36-39页 |
| ·菌株与试剂 | 第36-37页 |
| ·菌株培养 | 第37页 |
| ·pprI基因片段的克隆 | 第37页 |
| ·pprI基因突变株制备 | 第37页 |
| ·辐照处理后野生型与突变株的生存率 | 第37-38页 |
| ·野生型与突变株中RecA和PprA表达差异检测 | 第38页 |
| ·DR菌细胞提取液对自由基损伤DNA的保护作用 | 第38-39页 |
| ·过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性分析 | 第39页 |
| 3.结果与分析 | 第39-44页 |
| ·DNA修复缺陷株KH8401的辐射抗性鉴定 | 第39-40页 |
| ·转座子IS8301插入鉴定 | 第40-41页 |
| ·转座子IS8301插入位点的鉴定 | 第41-42页 |
| ·pprI基因突变株构建及鉴定 | 第42页 |
| ·RecA和PprA在野生型和突变株中表达差异 | 第42-43页 |
| ·PprI对自由基损伤DNA的抑制效果检测 | 第43-44页 |
| 4.讨论 | 第44-45页 |
| 5.小结 | 第45页 |
| 6.参考文献 | 第45-47页 |
| 第二章 耐辐射球菌pprI基因基于生物信息学方法的分析 | 第47-55页 |
| 1.引言 | 第47页 |
| 2.材料与方法 | 第47-48页 |
| ·材料 | 第47页 |
| ·方法 | 第47-48页 |
| 3.结果与分析 | 第48-53页 |
| ·pprI基因位置及序列、PprI氨基酸序列 | 第48-49页 |
| ·同源性检索 | 第49页 |
| ·结构域分析 | 第49-52页 |
| ·局部高级结构预测 | 第52-53页 |
| 4.讨论 | 第53-54页 |
| 5.小结 | 第54页 |
| 6.参考文献 | 第54-55页 |
| 第三章 耐辐射球菌pprI、recA和pprA克隆、表达及抗体制备 | 第55-72页 |
| 第一节 pprI基因克隆、表达、蛋白质纯化及抗体制备 | 第58-63页 |
| 1.实验方法 | 第58-60页 |
| ·pprI基因的克隆 | 第58页 |
| ·pprI基因的表达 | 第58-59页 |
| ·PprI重组蛋白的纯化 | 第59页 |
| ·PprI抗体制备 | 第59页 |
| ·PprI抗体纯化 | 第59-60页 |
| 2.结果与分析 | 第60-62页 |
| ·pprI基因的克隆 | 第60页 |
| ·pprI基因的表达与蛋白质纯化 | 第60-61页 |
| ·PprI抗体制备及纯化 | 第61-62页 |
| ·Western blot分析DR菌PprI的表达 | 第62页 |
| 3.讨论 | 第62-63页 |
| 第二节 recA基因克隆、表达、蛋白质纯化及抗体制备 | 第63-68页 |
| 1.实验方法 | 第63-64页 |
| ·recA基因克隆 | 第63页 |
| ·重组表达质粒和穿梭表达质粒的构建 | 第63-64页 |
| ·RecA重组蛋白的表达和纯化 | 第64页 |
| ·RecA多克隆抗体制备和Western blot分析 | 第64页 |
| ·RecA补偿对E.coli(recA~-)细胞辐射抗性的影响 | 第64页 |
| 2.结果和分析 | 第64-66页 |
| ·recA基因的克隆和表达质粒pET15brecA及pRADZ3recA的构建 | 第64-65页 |
| ·RecA蛋白表达和纯化 | 第65-66页 |
| ·E.coli(recA~-)中补偿DR菌RecA蛋白的免疫学分析 | 第66页 |
| ·DR菌RecA的补偿对E.coli(recA~-)细胞辐射抗性的影响 | 第66页 |
| 3.讨论 | 第66-68页 |
| 第三节 pprA基因的克隆、表达、蛋白质纯化及抗体制备 | 第68-72页 |
| 1.实验方法 | 第68页 |
| ·pprA基因的克隆和表达质粒的构建 | 第68页 |
| ·PprA重组蛋白的表达 | 第68页 |
| ·PprA融合蛋白质的纯化 | 第68页 |
| ·PprA的抗血清制备 | 第68页 |
| 2.结果与分析 | 第68-70页 |
| ·pprA基因的克隆 | 第68-69页 |
| ·PprA融合蛋白的表达 | 第69页 |
| ·PprA蛋白质的纯化 | 第69页 |
| ·PprA多克隆抗体制备 | 第69-70页 |
| 3.讨论 | 第70-72页 |
| 第四章 耐辐射球菌pprI在E.coli中的表达对其抗逆性的影响 | 第72-84页 |
| 1.引言 | 第72-73页 |
| 2.材料和方法 | 第73-75页 |
| ·材料和试剂 | 第73页 |
| ·pprI基因的克隆和穿梭表达载体的构建 | 第73页 |
| ·辐射条件下细菌的存活率 | 第73-74页 |
| ·辐射条件下PprI的补偿对E.coli RecA表达的影响 | 第74页 |
| ·化学发光法检测PprI的补偿对E.coli清除活性氧自由基能力的影响 | 第74-75页 |
| ·H_2O_2氧化压力下的存活率 | 第75页 |
| ·过氧化氢酶活性检测 | 第75页 |
| 3.结果与分析 | 第75-80页 |
| ·pprI基因扩增和pRADZ3pprI构建 | 第75-76页 |
| ·PprI的补偿对E.coli抗辐射的影响 | 第76页 |
| ·PprI的补偿对E.coli RecA表达的影响 | 第76-77页 |
| ·PprI的补偿对E.coli清除自由基能力的影响 | 第77-78页 |
| ·PprI的补偿对E.coli H2O2压力存活率影响 | 第78-79页 |
| ·PprI的补偿对E.coli过氧化氢酶活性的影响 | 第79-80页 |
| 4.讨论 | 第80-81页 |
| 5.小结 | 第81-82页 |
| 6.参考文献 | 第82-84页 |
| 第五章 耐辐射球菌pprI-folP基因簇启动子鉴定和基因表达 | 第84-96页 |
| 1.引言 | 第84-85页 |
| 2.材料与方法 | 第85-88页 |
| ·菌种与质粒 | 第85页 |
| ·培养与生长条件 | 第85页 |
| ·质粒DNA及基因组DNA操作 | 第85页 |
| ·folP突变株的制备 | 第85-86页 |
| ·启动子-lacZ的融合构建 | 第86页 |
| ·β-乳糖苷酶的分析 | 第86页 |
| ·RNA的提取和引物延伸试验 | 第86-87页 |
| ·射线处理后细胞生存率 | 第87页 |
| ·启动子胁迫分析 | 第87页 |
| ·Westren blot分析PprI表达水平 | 第87-88页 |
| 3.结果与分析 | 第88-94页 |
| ·DR0167-DR0170基因簇排布 | 第88页 |
| ·pprI和folP基因突变株构建及分析 | 第88-89页 |
| ·pprI基因启动子图谱及转录起始位点的鉴定 | 第89-91页 |
| ·补偿PprI的YA突变株生存率 | 第91-92页 |
| ·folP可能不与pprI形成一个操纵子 | 第92页 |
| ·辐照条件下启动子的活性分析 | 第92-93页 |
| ·辐射条件下PprI的表达分析 | 第93-94页 |
| 4.讨论 | 第94-95页 |
| 5.小结 | 第95页 |
| 6.参考文献 | 第95-96页 |
| 第六章 耐辐射球菌PprI结构域与功能的解析 | 第96-128页 |
| 第一节 DR-E.coli穿梭质粒pRADK和pRADG的构建及应用 | 第97-107页 |
| 1.引言 | 第97-98页 |
| 2.材料与方法 | 第98-101页 |
| ·菌株、质粒和培养条件 | 第98页 |
| ·穿梭质粒的构建 | 第98-100页 |
| ·质粒pRADK在DR菌突变株构建中的应用 | 第100页 |
| ·重组质粒pRADG荧光鉴定及分析 | 第100页 |
| ·质粒pRADG在DR菌中的应用 | 第100-101页 |
| 3.结果 | 第101-104页 |
| ·质粒pRADK的构建 | 第101页 |
| ·质粒pRADG的构建 | 第101-102页 |
| ·重组质粒pRADG荧光鉴定 | 第102页 |
| ·DR菌中RecA-eGFP融合蛋白表达和定位 | 第102页 |
| ·recA基因启动子胁迫活性检测 | 第102页 |
| ·基因功能补偿 | 第102-104页 |
| 4.讨论 | 第104-105页 |
| 5.小结 | 第105-106页 |
| 6.参考文献 | 第106-107页 |
| 第二节 耐辐射球菌pprI功能缺陷性和补偿性突变株体系的建立 | 第107-115页 |
| 1.引言 | 第107页 |
| 2.材料和方法 | 第107-109页 |
| ·材料与试剂 | 第107页 |
| ·pprI基因缺陷性突变株的建立 | 第107-108页 |
| ·含不同pprI基因片段的功能补偿质粒的构建 | 第108页 |
| ·辐照条件下各突变株的生长情况及生存率曲线 | 第108页 |
| ·Western杂交检测目的蛋白的表达 | 第108-109页 |
| 3.结果与分析 | 第109-113页 |
| ·DR菌pprI基因缺陷株基因组PCR鉴定 | 第109-110页 |
| ·不同长度pprI基因片断功能补偿质粒酶切鉴定结果 | 第110页 |
| ·Western杂交检测PprI蛋白在不同突变株中的表达 | 第110-111页 |
| ·辐照后突变株的生长情况 | 第111-112页 |
| ·辐照条件下突变株的生存率曲线 | 第112-113页 |
| 4.讨论 | 第113-114页 |
| 5.小结 | 第114页 |
| 6.参考文献 | 第114-115页 |
| 第三节 耐辐射球菌PprI结构域与辐射抗性的关系 | 第115-128页 |
| 1.引言 | 第115-116页 |
| 2.材料与方法 | 第116-119页 |
| ·材料 | 第116页 |
| ·pprI突变基因的产生及重组质粒的构建 | 第116-119页 |
| ·变异PprI蛋白补偿后的辐射抗性 | 第119页 |
| ·Western blot分析PprI PEST结构域与蛋白质稳定性的关系 | 第119页 |
| ·Western blot分析PprI C-末端与蛋白质稳定性的关系 | 第119页 |
| ·Western blot分析PprI C-末端对RecA表达的影响 | 第119页 |
| 3.结果与分析 | 第119-125页 |
| ·各种突变pprI基因穿梭质粒的构建 | 第119-120页 |
| ·补偿变异PprI蛋白后细胞的辐射抗性 | 第120-121页 |
| ·辐射条件下补偿变异PprI蛋白后细胞生长情况 | 第121-123页 |
| ·Western blot分析PprI PEST结构域对蛋白质稳定性的影响 | 第123页 |
| ·Western blot分析PprI C-末端与蛋白质稳定性的关系 | 第123页 |
| ·Western blot分析PprI C-末端对RecA表达的影响 | 第123-125页 |
| 4.讨论 | 第125-126页 |
| 5.小结 | 第126页 |
| 6.参考文献 | 第126-128页 |
| 第七章 蛋白质组学研究耐辐射球菌PprI网络调控机制 | 第128-146页 |
| 1.引言 | 第128-129页 |
| 2.材料与方法 | 第129-131页 |
| ·细胞培养和辐射处理 | 第129页 |
| ·细胞提取物的制备(样品制备) | 第129页 |
| ·双向电泳 | 第129页 |
| ·电泳凝胶染色 | 第129-130页 |
| ·图像分析和胶内酶解制备样品 | 第130页 |
| ·肽质量指纹谱测定 | 第130-131页 |
| ·数据库检索 | 第131页 |
| 3.结果与分析 | 第131-143页 |
| ·野生型菌株R1与pprI突变株YR1(未辐照处理)蛋白表达谱差异 | 第131-136页 |
| ·野生型菌株R1电离辐射前后蛋白表达谱差异 | 第136-140页 |
| ·pprI突变株YR1电离辐照前后蛋白表达谱差异 | 第140-141页 |
| ·辐照条件下R1与YR1蛋白表达谱差异 | 第141-143页 |
| 4.讨论 | 第143-144页 |
| 5.小结 | 第144页 |
| 6.参考文献 | 第144-146页 |
| 总论 | 第146-148页 |
| 博士期间发表论文(含待发表) | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149页 |
