| 英文缩略词表 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-19页 |
| Abatract | 第19-28页 |
| 第一章 绪论 | 第28-46页 |
| 第一节 植物医药基因工程的发展现状与存在问题 | 第28-41页 |
| 一 植物医药基因工程简介 | 第28页 |
| 二 转基因植物作为新型生物反应器的优点 | 第28-29页 |
| 三 目前转基因植物口服疫苗的研究现状 | 第29-32页 |
| (一) 转基因口服疫苗可行性实验依据 | 第29-30页 |
| (二) 植物细胞壁的“生物胶囊”作用 | 第30-32页 |
| 四 主要存在的问题及其应对策略分析 | 第32-41页 |
| (一) 外源基因表达量低甚至出现转基因沉默的现象及应对策略分析 | 第32-35页 |
| 1 转基因沉默及其假说 | 第32页 |
| 2 提高外源基因表达水平克服转基因沉默的应对策略分析 | 第32-35页 |
| (1) 启动子的选择 | 第32-33页 |
| (2) 抗原在植物细胞器内的定位表达 | 第33页 |
| (3) 位置效应的消除 | 第33-34页 |
| (4) 增强外源基因的翻译效率 | 第34-35页 |
| (5) 叶绿体转化 | 第35页 |
| (二) 增强免疫保护避免免疫耐受的策略分析 | 第35-37页 |
| 1 组装成类病毒颗粒可提高抗原抗消化能力 | 第36页 |
| 2 免疫佐剂的适当应用 | 第36-37页 |
| (三) 植物基因转化体的遗传稳定性 | 第37-39页 |
| 1 孟德尔遗传分离 | 第37-38页 |
| 2 非孟德尔遗传现象:转基因的丢失、沉默及逃逸等现象 | 第38页 |
| 3 转化方法对转基因遗传稳定性的影响 | 第38-39页 |
| 4 其它因素对转基因遗传稳定性的影响 | 第39页 |
| (四) 口服疫苗植物受体的选择 | 第39-40页 |
| (五) 安全性 | 第40-41页 |
| 1 环境安全方面 | 第40-41页 |
| 2 食品安全方面 | 第41页 |
| 第二节 植物医药基因工程在寄生虫病控制中的前景展望 | 第41-43页 |
| 第三节 弓形虫的疫苗研究 | 第43-45页 |
| 第四节 本论文的研究目的及主要内容 | 第45-46页 |
| 第二章 番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析 | 第46-61页 |
| 前言 | 第46页 |
| 材料 | 第46-47页 |
| 方法 | 第47-49页 |
| 一 中蔬5号番茄幼苗的培养及番茄基因组DNA的提取 | 第47-48页 |
| 二 PCR扩增番茄果实特异性E8启动子基因 | 第48-49页 |
| 三 重组T载体的构建与筛选鉴定 | 第49页 |
| 四 测序与同源性搜索 | 第49页 |
| 结果 | 第49-59页 |
| 一 中蔬5号番茄基因组DNA的提取 | 第49页 |
| 二 PCR结果 | 第49页 |
| 三 E81.1-pGEM-T和E82.2-pGEM-T重组质粒的鉴定 | 第49-51页 |
| 四 测序及序列分析结果 | 第51-57页 |
| 五 GENBANK登记 | 第57-59页 |
| 讨论 | 第59-61页 |
| 第三章 弓形虫MAG、tSAG1植物表达载体的构建 | 第61-87页 |
| 前言 | 第61-63页 |
| 第一部分 弓形虫MAG植物表达载体的构建 | 第63-76页 |
| 材料 | 第63-64页 |
| 方法 | 第64-70页 |
| 一 含MAG中间载体及植物表达载体的构建 | 第64-67页 |
| (一) E35S启动子驱动MAG的pB35MG、pC35MG载体的构建 | 第64-65页 |
| (二) E35S-E81.1复合式双启动子驱动MAG的pB35E1MG、pC35E1MG载体的构建 | 第65-67页 |
| (三) E82.2启动子驱动MAG的pBE2MG、pCE2MG载体的构建 | 第67页 |
| 二 植物表达载体中目的基因MAG的测序鉴定 | 第67页 |
| 三 根癌农杆菌LBA4404感受态的制备、转化及其鉴定 | 第67-70页 |
| (一) 根癌农杆菌LBA4404感受态的制备、转化 | 第67-69页 |
| (二) 含MAG植物表达载体转化农杆菌后的鉴定 | 第69-70页 |
| 结果 | 第70-76页 |
| 一 含MAG中间载体及植物表达载体的鉴定 | 第70-73页 |
| (一) pB35MG、pC35MG酶切鉴定 | 第70-71页 |
| (二) pB35E1MG、pC35E1MG酶切鉴定 | 第71-72页 |
| (三) pBE2MG、pCE2MG酶切鉴定 | 第72-73页 |
| 二 植物表达载体中目的基因MAG的测序鉴定 | 第73页 |
| 三 含MAG植物表达载体转化农杆菌LBA4404后的鉴定 | 第73-76页 |
| (一) 酶切鉴定 | 第73-74页 |
| (二) PCR鉴定 | 第74-75页 |
| (三) 简化的PCR鉴定法 | 第75-76页 |
| 第二部分 弓形虫tSAG1植物表达载体的构建 | 第76-87页 |
| 材料 | 第76页 |
| 方法 | 第76-78页 |
| 一 pMD-T-tSAG1载体的构建 | 第76-77页 |
| (一) 引物设计 | 第76页 |
| (二) PCR扩增及其产物纯化 | 第76-77页 |
| (三) 重组载体的构建与筛选鉴定 | 第77页 |
| (四) 测序与序列分析 | 第77页 |
| 二 三种启动子驱动tSAG1中间载体的构建 | 第77页 |
| 三 三种启动子驱动tSAG1植物表达载体的构建 | 第77-78页 |
| 四 根癌农杆菌LBA4404感受态的制备、转化及其鉴定 | 第78页 |
| 结果 | 第78-82页 |
| 一 pMD-T-tSAG1重组质粒的鉴定 | 第78页 |
| 二 三种启动子驱动tSAG1中间载体的鉴定 | 第78-80页 |
| 三 三种启动子驱动tSAG1植物表达载体的鉴定 | 第80-81页 |
| 四 含tSAG1植物表达载体转化农杆菌LBA4404后的鉴定 | 第81-82页 |
| 讨论 | 第82-87页 |
| 一 外源目的基因的选择 | 第82-84页 |
| (一) 多表位抗原基因(MAG) | 第82-83页 |
| (二) 弓形虫速殖子主要表面抗原1(SAG1) | 第83-84页 |
| 二 启动子的选择 | 第84-85页 |
| 三 克隆策略的选择与优化 | 第85-86页 |
| 四 植物表达载体导入根癌农杆菌后的鉴定方法比较 | 第86-87页 |
| 第四章 弓形虫MAG和tSAG1对番茄的转化研究 | 第87-105页 |
| 前言 | 第87页 |
| 材料 | 第87-90页 |
| 一 植物材料与菌种 | 第87-88页 |
| 二 主要溶液和培养基的配制 | 第88-89页 |
| 三 MS系列使用培养基 | 第89-90页 |
| 四 植物激素类 | 第90页 |
| 方法 | 第90-93页 |
| 一 番茄无菌苗的培养 | 第90页 |
| 二 番茄高频再生体系的建立 | 第90-91页 |
| (一) 番茄外植体的选择 | 第90页 |
| (二) 激素的选择 | 第90-91页 |
| (三) 培养条件 | 第91页 |
| 三 弓形虫MAG和tSAG1对番茄外植体的转化 | 第91-93页 |
| (一) 农杆菌浸染悬浮液的准备 | 第91页 |
| (二) 外植体的预培养、浸染和共培养 | 第91-92页 |
| (三) 筛选培养与植株再生 | 第92-93页 |
| 结果 | 第93-102页 |
| 一 番茄无菌苗的培养 | 第93页 |
| 二 番茄高频再生体系的建立 | 第93-94页 |
| 三 弓形虫MAG和tSAG1对番茄外植体的转化 | 第94-102页 |
| (一) 番茄转化体系的优化 | 第94-99页 |
| (二) 番茄转化体的生根筛选培养与转基因植株的再生 | 第99-102页 |
| 讨论 | 第102-105页 |
| 第五章 弓形虫MAG和tSAG1在转基因番茄中整合和表达的分子鉴定 | 第105-131页 |
| 前言 | 第105-106页 |
| 材料 | 第106-108页 |
| 一 植物材料 | 第106页 |
| 二 主要试剂 | 第106-107页 |
| 三 主要仪器 | 第107页 |
| 四 主要溶液的配制 | 第107-108页 |
| 方法 | 第108-115页 |
| 一 PCR对转基因番茄植株DNA水平的检测 | 第108-109页 |
| (一) 转基因番茄植株DNA的提取 | 第108-109页 |
| (二) PCR扩增 | 第109页 |
| (三) 琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第109页 |
| 二 RT-PCR对转基因番茄植株转录水平RNA的鉴定 | 第109-111页 |
| (一) 转基因番茄植株总RNA的提取 | 第109-110页 |
| (二) RT-PCR分析鉴定 | 第110-111页 |
| 三 转基因番茄植株中目的基因表达蛋白的鉴定与分析 | 第111-115页 |
| (一) 植物总蛋白的提取 | 第111页 |
| (二) 植物总蛋白的超滤浓缩 | 第111-112页 |
| (三) Western blot分析 | 第112-113页 |
| (四) 转基因番茄果实的真空冷冻干燥 | 第113-115页 |
| 1 真空冷冻干燥 | 第113页 |
| 2 冻干果实总蛋白的提取 | 第113页 |
| 3 冻干果实中表达的目的蛋白弓形虫MAG的免疫反应性评价 | 第113-115页 |
| 结果 | 第115-126页 |
| 一 PCR检测 | 第115-116页 |
| 二 RT-PCR鉴定 | 第116-118页 |
| 三 转基因番茄植株中目的基因表达蛋白的鉴定与分析 | 第118-126页 |
| (一) 弓形虫MAG转基因番茄植株中蛋白表达的筛选鉴定 | 第118-119页 |
| 1 Western blot筛选 | 第118页 |
| 2 与HRP-K_7H_3呈强反应植株No.28各期蛋白Western blot识别 | 第118-119页 |
| 3 真空冷冻干燥果实目的蛋白免疫反应性评价 | 第119页 |
| (二) 弓形虫tSAG1转基因番茄植株蛋白 | 第119-126页 |
| 讨论 | 第126-131页 |
| 第六章 转基因番茄植株T1代遗传稳定性的初步分析 | 第131-136页 |
| 前言 | 第131-132页 |
| 材料与方法 | 第132页 |
| 结果 | 第132-135页 |
| 讨论 | 第135-136页 |
| 结论 | 第136-140页 |
| 主要参考文献 | 第140-150页 |
| 声明 | 第150-151页 |
| 博士生期间发表论文、基金申请、获奖情况一览表 | 第151-153页 |
| 致谢 | 第153-154页 |
