| 缩略词表 | 第1-14页 |
| 中文摘要 | 第14-17页 |
| 英文摘要 | 第17-21页 |
| 前言 | 第21-32页 |
| 1. 酵母表达系统概况 | 第21-25页 |
| ·毕赤酵母表达系统优点及其应用 | 第21-23页 |
| ·毕赤酵母表达系统存在的问题 | 第23-25页 |
| 2. 限制酶介导整合技术 | 第25-27页 |
| ·REMI 技术的基本原理 | 第25-26页 |
| ·REMI 技术的应用现状 | 第26-27页 |
| 3. Cre-loxP 同源重组系统 | 第27-28页 |
| 4. TAIL-PCR 技术 | 第28-30页 |
| 5. Error-prone PCR | 第30-31页 |
| 6. 本课题目的及意义 | 第31-32页 |
| 第一章：Pichia pastoris 适用的Cre-loxP 重组系统构建与初步评价 | 第32-73页 |
| ·实验材料 | 第32-37页 |
| ·菌株、质粒和细胞 | 第32页 |
| ·工具酶和分子量标准 | 第32-33页 |
| ·主要试剂、耗材及试剂盒 | 第33-34页 |
| ·主要仪器及配件 | 第34页 |
| ·主要溶液 | 第34-36页 |
| ·主要培养基 | 第36-37页 |
| ·实验方法 | 第37-59页 |
| ·pLOXP-Z 载体的构建 | 第37-40页 |
| ·LML 片段体外构建 | 第37-38页 |
| ·pUC+Zeo 片段的PCR 扩增 | 第38页 |
| ·LML 片段和pUC+Zeo 片段PstI/XhoI 双酶切 | 第38-39页 |
| ·LML 片段和pUC+Zeo 片段PstI/XhoI 酶切产物连接 | 第39页 |
| ·LML 片段和pUC+Zeo 片段的酶切产物转化大肠杆菌DH5α | 第39页 |
| ·pLOXP-Z 质粒菌落PCR 筛选 | 第39-40页 |
| ·pLOXP-Z 质粒PstI/XhoI 酶切鉴定 | 第40页 |
| ·pGAP-Z 质粒的构建 | 第40-42页 |
| ·GS115 基因组DNA 提取 | 第40页 |
| ·GAP 启动子扩增 | 第40-41页 |
| ·GAP 启动子与pPICZαA 质粒BglII/EcoRI 酶切 | 第41页 |
| ·GAP 启动子与pPICZαA 质粒BglII/EcoRI 酶切产物连接 | 第41页 |
| ·GAP 启动子与pPICZαA 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第41-42页 |
| ·pGAP-Z 质粒菌落PCR 筛选 | 第42页 |
| ·pGAP-Z 质粒BglII/EcoRI 酶切鉴定 | 第42页 |
| ·pGAPA 质粒的构建 | 第42-45页 |
| ·GAP+AOX1TT 片段的克隆 | 第42-43页 |
| ·Amp+ColE1 片段的克隆 | 第43页 |
| ·GAP+AOX1TT 片段与Amp+ColE1 片段BglII/SpeI 酶切 | 第43-44页 |
| ·GAP+AOX1TT 片段与Amp+ColE1 片段BglII | 第44页 |
| ·GAP+AOX1TT 与Amp+ColE1 的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第44页 |
| ·pGAPA 质粒菌落PCR 筛选 | 第44-45页 |
| ·pGAPA 质粒BglII/SpeI 酶切鉴定 | 第45页 |
| ·pGAPK 质粒的构建 | 第45-47页 |
| ·Kanamycin 抗性基因片段的克隆 | 第45-46页 |
| ·Kanamycin 抗性基因片段与pGAPA 质粒BglII 酶切 | 第46页 |
| ·Kanamycin 抗性基因片段与pGAPA 质粒BglII 酶切产物连接 | 第46页 |
| ·Kanamycin 片段与pGAPA 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第46页 |
| ·pGAPK 质粒菌落PCR 筛选 | 第46-47页 |
| ·pGAPK 质粒BglII 酶切鉴定 | 第47页 |
| ·pARSK 质粒的构建 | 第47-49页 |
| ·Pichia pastoris 自主复制序列ARS 片段的克隆 | 第47-48页 |
| ·Pp-ARS 片段与pGAPK 质粒BamHI/SpeI 酶切 | 第48页 |
| ·Pp-ARS 片段与pGAPK 质粒BamHI/SpeI 酶切产物连接 | 第48-49页 |
| ·Pp-ARS 片段与pGAPK 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第49页 |
| ·pARSK 质粒菌落PCR 筛选 | 第49页 |
| ·pARSK 质粒BamHI/SpeI 酶切鉴定 | 第49页 |
| ·pCREK 质粒的构建 | 第49-52页 |
| ·Cre 重组酶基因的克隆 | 第50页 |
| ·Cre 重组酶基因片段与pARSK 质粒EcoRI/NotI 酶切 | 第50页 |
| ·Cre 重组酶基因片段与pARSK 质粒EcoRI/NotI 酶切产物连接 | 第50-51页 |
| ·Cre 基因片段与pARSK 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第51页 |
| ·pCREK 质粒菌落PCR 筛选 | 第51页 |
| ·pCREK 质粒EcoRI/NotI 酶切鉴定 | 第51-52页 |
| ·pYPS1-delta 质粒的构建 | 第52-55页 |
| ·同源臂YPS1_N 和YPS1_C 片段扩增 | 第52页 |
| ·融合PCR 构建YPS1(C+N)片段 | 第52-53页 |
| ·YPS1(C+N)片段和pLOXP-Z 质粒BglII/SalI 酶切 | 第53页 |
| ·YPS1(C+N)片段和pLOXP-Z 质粒BglII/SalI 酶切产物连接 | 第53-54页 |
| ·YPS1(C+N)和pLOXP-Z 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第54页 |
| ·pYPS1-delta 质粒菌落PCR 筛选 | 第54页 |
| ·pYPS1-delta 质粒BglII/SalI 酶切鉴定 | 第54-55页 |
| ·GS115 菌株YPS1 基因敲除与PCR 筛选鉴定 | 第55-56页 |
| ·pYPS1-delta 质粒ScaI 酶切与回收 | 第55页 |
| ·GS115 感受态细胞制备与转化 | 第55页 |
| ·Zeocin 抗性重组子基因组DNA 提取 | 第55-56页 |
| ·PCR 鉴定Zeocin 抗性重组子 | 第56页 |
| ·GS115 YPS1△::Shble 菌株中Zeocin 抗性基因（Sh ble）剔除 | 第56-57页 |
| ·GS115 YPS1△::Shble 菌株感受态细胞制备与转化 | 第57页 |
| ·含有pCREK 质粒的GS115 YPS1△::Shble 菌株传代培养 | 第57页 |
| ·传代培养去除pCREK 质粒 | 第57页 |
| ·GS115 YPS1△菌株Southern Blot 分析鉴定 | 第57-58页 |
| ·GS115-pPIC9-HSA-AX15(R13K) YPS1△和GS115-pPIC9 YPS1△菌株构建 | 第58-59页 |
| ·GS115 YPS1△菌株感受态细胞制备与转化 | 第58页 |
| ·GS115-pPIC9-HSA-AX15(R13K) YPS1△和GS115-pPIC9 YPS1△菌株甲醇利用表型确定 | 第58页 |
| ·GS115-pPIC9-HSA-AX15(R13K)工程菌摇瓶诱导表达 | 第58-59页 |
| ·实验结果 | 第59-73页 |
| ·pLOXP-Z 载体的构建 | 第59-61页 |
| ·pCREK 质粒的构建 | 第61-67页 |
| ·pGAP-Z 质粒的构建 | 第61-63页 |
| ·pGAPA 质粒的构建 | 第63-64页 |
| ·pGAPK 质粒的构建 | 第64-65页 |
| ·pARSK 质粒的构建 | 第65-66页 |
| ·pCREK 质粒的构建 | 第66-67页 |
| ·Cre-loxP 重组系统的初步评价 | 第67-73页 |
| ·pYPS1-delta 打靶质粒的构建 | 第68-69页 |
| ·GS115 YPS1△菌株的构建 | 第69-73页 |
| 第二章：Pichia pastoris LacZ 模式菌株构建 | 第73-118页 |
| ·实验材料 | 第73-74页 |
| ·菌株、质粒和细胞 | 第73页 |
| ·工具酶和分子量标准 | 第73页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第73页 |
| ·主要仪器及配件 | 第73页 |
| ·主要溶液 | 第73-74页 |
| ·主要培养基 | 第74页 |
| ·实验方法 | 第74-80页 |
| ·pEM22b 载体的构建 | 第74-76页 |
| ·EM7 启动子PCR 扩增 | 第74页 |
| ·EM7 启动子PCR 片段和pET226(+)载体BglII/NdeI 酶切 | 第74-75页 |
| ·EM7 启动子片段和pET226(+)载体BglII/NdeI 酶切产物连接 | 第75页 |
| ·EM7 片段和pET226(+)载体的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第75页 |
| ·pEM22b 质粒菌落PCR 筛选 | 第75-76页 |
| ·pEM22b 质粒BglII/NdeI 酶切鉴定 | 第76页 |
| ·pEM22b-LacZ 质粒的构建 | 第76-78页 |
| ·lacZ 基因PCR 扩增 | 第76-77页 |
| ·lacZ 基因PCR 扩增产物和pEM22b 载体BamHI/NcoI 酶切 | 第77页 |
| ·lacZ 基因和pEM22b 载体BamHI/NcoI 酶切产物连接 | 第77页 |
| ·lacZ 基因和pEM22b 载体的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第77-78页 |
| ·pEM22b-LacZ 质粒AvrII/XhoI 酶切鉴定 | 第78页 |
| ·pPIC9-LacZ 质粒的构建 | 第78-80页 |
| ·pPIC9 载体AvrII/XhoI 酶切 | 第78页 |
| ·lacZ 基因pPIC9 载体的AvrII/XhoI 酶切产物连接 | 第78-79页 |
| ·lacZ 基因pPIC9 载体的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第79页 |
| ·pPIC9-LacZ 质粒菌落PCR 筛选 | 第79页 |
| ·pPIC9-LacZ 质粒菌落AvrII/XhoI 酶切鉴定 | 第79-80页 |
| ·GS115-pPIC9-LacZ YPS1△工程菌构建 | 第80页 |
| ·pPIC9-LacZ 质粒BglII 酶切与回收 | 第80页 |
| ·GS115 YPS1△感受态细胞制备与转化 | 第80页 |
| ·筛选GS115-pPIC9-LacZ YPS1△工程菌阳性克隆 | 第80页 |
| ·GS115-pPIC9-LacZ YPS1△工程菌甲醇利用表型确定 | 第80页 |
| ·实验结果 | 第80-86页 |
| ·pEM22b 载体构建 | 第80-82页 |
| ·pEM22b-LacZ 质粒构建 | 第82-84页 |
| ·pPIC9-LacZ 质粒构建 | 第84-85页 |
| ·GS115-pPIC9-LacZ YPS1△模式菌株构建 | 第85-86页 |
| 第三章：REMI 突变库技术构建甘油去阻遏Pichia pastoris 菌株及其评价 | 第86页 |
| ·实验材料 | 第86-88页 |
| ·菌株、质粒和细胞 | 第86页 |
| ·工具酶和分子量标准 | 第86-87页 |
| ·主要试剂、耗材及试剂盒 | 第87页 |
| ·主要仪器及配件 | 第87页 |
| ·主要溶液 | 第87-88页 |
| ·主要培养基 | 第88页 |
| ·实验方法 | 第88-101页 |
| ·pREMI-Z 质粒的构建 | 第88-91页 |
| ·TBS 片段体外构建 | 第88-89页 |
| ·TBS 片段PstI/XhoI 双酶切 | 第89页 |
| ·TBS 片段和pUC+Zeo 片段PstI/XhoI 酶切产物连接 | 第89-90页 |
| ·TBS 片段和pUC+Zeo 片段的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第90页 |
| ·pREMI-Z 质粒菌落PCR 筛选 | 第90页 |
| ·pREMI-Z 质粒PstI/XhoI 酶切鉴定 | 第90-91页 |
| ·毕赤酵母GS115-pPIC9-LacZ YPS1△菌株REMI 随机突变库构建与筛选 | 第91页 |
| ·GS115-pPIC9-LacZ YPS1△感受态细胞制备与转化 | 第91页 |
| ·Zeocin 抗性重组子菌落影印接种及阳性重组子验证 | 第91页 |
| ·GS115-pPIC9-LacZ YPS1△ GR?菌株Southern Blot 分析 | 第91页 |
| ·GR1 基因分离与克隆 | 第91-95页 |
| ·pREMI-Z 质粒拯救 | 第91-92页 |
| ·5’TAIL-PCR 和3’TAIL-PCR | 第92-94页 |
| ·GR1 基因全序列克隆 | 第94-95页 |
| ·pGR1-delta 质粒的构建 | 第95-98页 |
| ·同源臂GR1_N 和GR1_C 片段扩增 | 第95页 |
| ·融合PCR 构建GR1(C+N)片段 | 第95-96页 |
| ·GR1(C+N)片段和pLOXP-Z 质粒NdeI 酶切 | 第96页 |
| ·GR1(C+N)片段和pLOXP-Z 质粒NdeI 酶切产物连接 | 第96-97页 |
| ·GR1(C+N)和pLOXP-Z 质粒的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第97页 |
| ·pGR1-delta 质粒菌落PCR 筛选 | 第97页 |
| ·pGR1-delta 质粒NdeI 酶切鉴定 | 第97-98页 |
| ·GS115 菌株GR1 基因敲除及其PCR 筛选鉴定 | 第98-99页 |
| ·pGR1-delta 质粒DraI 酶切与回收 | 第98页 |
| ·GS115 YPS1△感受态细胞制备与转化 | 第98页 |
| ·Zeocin 抗性重组子基因组DNA 提取 | 第98页 |
| ·PCR 鉴定Zeocin 抗性重组子 | 第98-99页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△::Shble 菌株中Zeocin 抗性基因（Sh ble）剔除 | 第99页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△::Shble 菌株感受态细胞制备与转化 | 第99页 |
| ·含有pCREK 质粒的GS115 YPS1△ gr1△::Shble 菌株传代培养 | 第99页 |
| ·传代培养去除pCREK 质粒 | 第99页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△菌株Southern Blot 分析鉴定 | 第99页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△菌株生长与形态测定 | 第99-100页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△菌株生长曲线 | 第99页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△菌株革兰氏染色 | 第99-100页 |
| ·GS115-pPIC9-HSA-AX15(R13K) YPS1△ gr1△和GS115-pPIC9-LacZ YPS1△gr1△菌株构建 | 第100页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△菌株感受态细胞的制备与转化 | 第100页 |
| ·GS115-pPIC9-HSA-AX15(R13K) YPS1△ gr1△和 GS115-pPIC9-LacZ YPS1△ gr1△菌株甲醇利用表型确定 | 第100页 |
| ·GS115-pPIC9-HSA-AX15(R13K)工程菌摇瓶诱导表达 | 第100页 |
| ·GS115-pPIC9-LacZ YPS1△与GS115-pPIC9-LacZ YPS1△ gr1△菌株LacZ 表达水平检测 | 第100-101页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△菌株中AOX1 活性检测 | 第101页 |
| ·实验结果 | 第101-118页 |
| ·pREMI-Z 质粒的构建 | 第101-103页 |
| ·GS115-pPIC9-LacZ YPS1△菌株REMI 随机突变库构建与筛选鉴定 | 第103-105页 |
| ·GR1 基因分离与克隆 | 第105-109页 |
| ·pGR1-delta 打靶质粒的构建 | 第109-111页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△菌株的构建 | 第111-114页 |
| ·GS115-pPIC9-HSA-AX15(R13K) YPS1△ gr1△菌株诱导表达 | 第114-116页 |
| ·GS115-pPIC9-LacZ YPS1△ gr1△菌株LacZ 表达水平测定 | 第116页 |
| ·GS115 YPS1△ gr1△菌株中AOX1 活性检测 | 第116-118页 |
| 第四章：Error-prone PCR 突变库技术构建甘油去阻遏Pichia pastoris 菌株 | 第118-137页 |
| ·实验材料 | 第118-119页 |
| ·菌株、质粒和细胞 | 第118页 |
| ·工具酶和分子量标准 | 第118页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第118-119页 |
| ·主要仪器及配件 | 第119页 |
| ·主要溶液 | 第119页 |
| ·主要培养基 | 第119页 |
| ·实验方法 | 第119-128页 |
| ·pPIC9ZαA-LacZ 质粒的构建 | 第119-121页 |
| ·Zeo+pUC(SpeI)片段克隆 | 第119-120页 |
| ·Zeo+pUC(SpeI)片段BamHI/BglII 酶切 | 第120页 |
| ·Zeo+pUC(SpeI)片段BamHI/BglII 酶切产物连接 | 第120页 |
| ·Zeo+pUC(SpeI)片段和pPIC9-LacZ BglII 大片段的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第120-121页 |
| ·pPIC9ZαA-LacZ 质粒菌落PCR 筛选 | 第121页 |
| ·pPIC9ZαA-LacZ 质粒BamHI/SpeI 酶切鉴定 | 第121页 |
| ·AOX1 启动子随机突变库构建 | 第121-124页 |
| ·Error-prone PCR 扩增AOX1 启动子 | 第122-123页 |
| ·AOX1 启动子Error-prone PCR 产物Bam HI/SpeI 酶切 | 第123页 |
| ·AOX1 启动子BamHI/SpeI 酶切连接 | 第123-124页 |
| ·AOX1 启动子和pPIC9ZαA-LacZ 的连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第124页 |
| ·AOX1 启动子随机突变库收集 | 第124页 |
| ·GS115-pPIC9ZαA-LacZ-ep YPS1△菌株构建及筛选鉴定 | 第124页 |
| ·GS115 YPS1△菌株感受态细胞制备与转化 | 第124页 |
| ·影印接种 | 第124页 |
| ·AOX1 启动子突变序列分析 | 第124-125页 |
| ·GS115-pPIC9ZαA-LacZ-epN 菌株LacZ 表达水平测定 | 第125页 |
| ·pPIC9AM 载体的构建 | 第125-127页 |
| ·AOX1 突变启动子AOX1-Mu 片段扩增 | 第125-126页 |
| ·AOX1-Mu 片段BamHI/BglII 酶切 | 第126页 |
| ·AOX1-Mu 片段BamHI/BglII 酶切产物连接 | 第126页 |
| ·AOX1-Mu 片段和pPIC9 大片段连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第126页 |
| ·pPIC9AM 载体菌落PCR 筛选 | 第126-127页 |
| ·pPIC9AM 质粒BamHI/BglII 酶切鉴定 | 第127页 |
| ·GS115-pPIC9AM-HSA-AX15(R13K) yps1? 和 GS115-pPIC9AM-LacZ YPS1△菌株构建 | 第127-128页 |
| ·pPIC9AM-HSA-AX15(R13K)与pPIC9AM-LacZ 质粒构建 | 第127页 |
| ·GS115 YPS1△菌株感受态细胞的制备与转化 | 第127-128页 |
| ·GS115-pPIC9AM-HSA-AX15(R13K) yps1?和 GS115-pPIC9AM-LacZ YPS1△菌株甲醇利用表型确定 | 第128页 |
| ·GS115-pPIC9-LacZ YPS1△与GS115-pPIC9AM-LacZ YPS1△菌株LacZ 表达水平检测 | 第128页 |
| ·GS115-pPIC9AM-HSA-AX15(R13K)工程菌摇瓶诱导表达 | 第128页 |
| ·实验结果 | 第128-137页 |
| ·pPIC9ZαA-LacZ 质粒的构建 | 第128-130页 |
| ·AOX1 启动子随机突变库构建 | 第130-131页 |
| ·甘油去阻遏的GS115-pPIC9ZαA-LacZ-ep YPS1△菌株构建与筛选鉴定 | 第131-132页 |
| ·AOX1 启动子突变序列分析 | 第132-133页 |
| ·GS115-pPIC9ZαA-LacZ-epN YPS1△菌株LacZ 表达水平测定 | 第133页 |
| ·pPIC9AM 载体的构建 | 第133-134页 |
| ·GS115-pPIC9AM-HSA-AX15(R13K) YPS1△菌株诱导表达 | 第134-136页 |
| ·GS115-pPIC9AM-LacZ YPS1△菌株LacZ 表达水平测定 | 第136-137页 |
| 讨论 | 第137-143页 |
| 结论 | 第143-144页 |
| 参考文献 | 第144-153页 |
| 附录 | 第153-156页 |
| 致谢 | 第156-157页 |
| 个人简历 | 第157-158页 |
| 攻读期间发表的研究论文 | 第158页 |
