| 摘要 | 第1-7页 |
| Summary | 第7-17页 |
| 引言 | 第17-19页 |
| 第一篇 文献综述 | 第19-72页 |
| 第一章 RNA干扰从基础研究到治疗应用的研究进展 | 第19-48页 |
| 1 RNAi的作用机制 | 第19-21页 |
| 2 哺乳动物细胞中siRNAs抑制基因表达的特点 | 第21-22页 |
| 3 siRNA分子的设计和结构稳定siRNA | 第22-26页 |
| ·设计siRNA分子 | 第22-24页 |
| ·化学改变的siRNA | 第24-26页 |
| 4 载体表达shRNA | 第26-28页 |
| ·质粒表达shRNA | 第26-27页 |
| ·可诱导的系统 | 第27-28页 |
| 5 siRNA的制备和导入方法 | 第28-29页 |
| ·siRNA的获取 | 第28-29页 |
| ·化学合成法 | 第28页 |
| ·体外转录法 | 第28页 |
| ·以质粒载体在体内进行转录 | 第28页 |
| ·PCR制备的siRNA表达盒在细胞内的表达 | 第28-29页 |
| 6 在体内以非病毒方法靶向运送siRNAs的策略 | 第29-38页 |
| ·在体内转运siRNA的障碍 | 第30-32页 |
| ·siRNA治疗的副反应 | 第32页 |
| ·siRNA靶向性运送——解决siRNA体内运送的良好策略 | 第32-38页 |
| ·脂质体或脂类物质 | 第33-35页 |
| ·阳离子多聚物 | 第35-36页 |
| ·阳离子多肽 | 第36-37页 |
| ·适配子(aptamer)介导的传递 | 第37-38页 |
| 7 结语 | 第38-40页 |
| 参考文献 | 第40-48页 |
| 第二章 狂犬病及狂犬病治疗制品的研究进展 | 第48-72页 |
| 1 狂犬病概述 | 第48-58页 |
| ·狂犬病毒的形态与结构 | 第48-50页 |
| ·病毒形态 | 第48-49页 |
| ·病毒结构 | 第49-50页 |
| ·狂犬病病毒的基因组 | 第50-53页 |
| ·狂犬病的发病机理 | 第53-56页 |
| ·病毒的侵入 | 第53-55页 |
| ·病毒由外周神经进入中枢神经 | 第55页 |
| ·中枢神经系统的感染 | 第55-56页 |
| ·病毒白中枢神经系统向外周器官扩散 | 第56页 |
| ·人类狂犬病防治 | 第56-58页 |
| ·传染源控制 | 第56-57页 |
| ·人类狂犬病的防治 | 第57-58页 |
| 2 狂犬病治疗性抗体 | 第58-65页 |
| ·抗RV单克隆抗体(单抗)的识别位点 | 第59页 |
| ·抗RV单抗的研发过程 | 第59-61页 |
| ·抗RV单抗——S057 | 第59-60页 |
| ·抗RV单抗——CR57和CR4098 | 第60-61页 |
| ·抗体介导的传递 | 第61-62页 |
| ·单链抗体及其在狂犬病治疗中的应用 | 第62-64页 |
| ·单链抗体与单克隆抗体比较 | 第62-63页 |
| ·单链抗体的基因构建 | 第63页 |
| ·存在的问题及前景展望 | 第63-64页 |
| ·狂犬病毒单链抗体及小分子抗体研究进展 | 第64-65页 |
| 3 结语 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 第二篇 研究内容 | 第72-127页 |
| 第一章 狂犬病人源二硫键稳定单链抗体表达及生物学活性研究 | 第72-85页 |
| 1 材料和方法 | 第73-78页 |
| ·材料 | 第73-74页 |
| ·菌株、毒株和载体 | 第73页 |
| ·试剂 | 第73-74页 |
| ·单抗S057可变区基因序列 | 第74页 |
| ·主要仪器 | 第74页 |
| ·方法 | 第74-76页 |
| ·主要试剂配制 | 第74页 |
| ·scdsFv的表达纯化 | 第74-76页 |
| ·scdsFv蛋白纯化、复性 | 第76页 |
| ·抗狂犬病毒scdsFv的特性鉴定 | 第76-78页 |
| ·抗狂犬病毒scdsFv的抗原特异性结合活性(ELISA检测) | 第76-77页 |
| ·抗狂犬病毒scdsFv的相对亲和力测定 | 第77页 |
| ·scdsFv中和活性检测 | 第77页 |
| ·小鼠血清中和试验法测定scdsFv表达产物中和活性 | 第77-78页 |
| ·scdsFv蛋白与鼠脑组织中RV结合能力检测 | 第78页 |
| 2 结果 | 第78-81页 |
| ·scdsFv片段的克隆与表达载体的构建 | 第78页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第78-79页 |
| ·融合蛋白的Ni-NTA纯化、复性 | 第79页 |
| ·FAVN法测定scdsFv抗体的效价 | 第79页 |
| ·scdsFv抗体相对亲和力测定 | 第79-80页 |
| ·抗狂犬病毒scdsFv的抗原特异性结合活性(ELISA检测)结果 | 第80页 |
| ·小鼠体内中和试验测定scdsFv中和活性结果 | 第80-81页 |
| ·小鼠脑内狂犬病毒抗原的间接免疫荧光反应 | 第81页 |
| 3 讨论 | 第81-84页 |
| 参考文献 | 第84-85页 |
| 第二章 靶向狂犬病毒N基因shRNA抑制狂犬病毒复制的研究 | 第85-97页 |
| 1 材料与方法 | 第86-90页 |
| ·病毒、质粒与细胞株 | 第86页 |
| ·主要试剂和引物 | 第86页 |
| ·siRNA序列设计及寡核苷酸合成 | 第86-87页 |
| ·重组质粒.的构建与抗性细胞系的建立 | 第87-88页 |
| ·重组质粒的构建与鉴定 | 第87页 |
| ·重组质粒的纯化与抗性细胞系的建立 | 第87-88页 |
| ·抗性细胞系中绿色荧光蛋白(GFP)表达的观察 | 第88页 |
| ·双标准曲线相对定量法检测特异性siRNA抑制RV复制效率 | 第88-90页 |
| ·标准品的制备 | 第88-89页 |
| ·Real-time RT-PCR试验 | 第89-90页 |
| ·病毒感染力测定(TCID_(50)) | 第90页 |
| ·直接免疫荧光法检测特异性siRNA抑制RV复制效率 | 第90页 |
| ·Western blot检测RV N蛋白的表达 | 第90页 |
| ·统计学方法 | 第90页 |
| 2 结果 | 第90-94页 |
| ·重组干扰载体的鉴定和阳性克隆细胞的筛选 | 第90-91页 |
| ·扩大培养的阳性克隆细胞中绿色荧光蛋白观察结果 | 第91页 |
| ·荧光定量PCR试验结果 | 第91页 |
| ·标准曲线的建立 | 第91页 |
| ·样品扩增实时检测结果 | 第91页 |
| ·病毒感染力测定结果 | 第91-93页 |
| ·直接免疫荧光(DFA)试验结果 | 第93页 |
| ·Western blot结果 | 第93-94页 |
| 3 讨论 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-97页 |
| 第三章 基于狂犬病病毒G蛋白scdsFv介导的靶向shRNA制备与鉴定 | 第97-111页 |
| 1 材料和方法 | 第98-103页 |
| ·材料 | 第98-99页 |
| ·病毒、细胞、菌株 | 第98页 |
| ·质粒 | 第98-99页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第99页 |
| ·引物 | 第99页 |
| ·狂犬病病毒细胞感染力(TCID_(50))测定 | 第99-100页 |
| ·scdsFv(G)-ETA-GAL4嵌合蛋白基因的构建 | 第100-101页 |
| ·scdsFv(G)-ETA-GAL4蛋白表达、纯化 | 第101页 |
| ·scdsFv(G)-ETA-GAL4纯化蛋白鉴定 | 第101页 |
| ·Western blotting | 第101页 |
| ·ELISA法鉴定SEG蛋白与RV结合特异性 | 第101页 |
| ·质粒pRNATU6.3-shRNA的大量制备与纯化 | 第101-102页 |
| ·scdsFv(G)-ETA-GAL4与质粒pRNATU6.3-shRNA最佳结合比例测定 | 第102页 |
| ·SEG蛋白与pRNATU6.3-shRNA载体复合物对病毒感染细胞的作用 | 第102-103页 |
| ·SEG蛋白转运pRNATU6.3-shRNA质粒进入病毒感染细胞检测 | 第102页 |
| ·SEG/pRNATU6.3-shRNA复合物抑制病毒复制检测 | 第102-103页 |
| 2 结果和分析 | 第103-107页 |
| ·狂犬病毒ERA株TCID_(50)的测定结果 | 第103页 |
| ·scdsFv(G)-ETA-GAL4原核表达载体的构建与鉴定 | 第103-104页 |
| ·SEG表达产物SDS-PAGE鉴定 | 第104页 |
| ·scdsFv(G)-ETA-GAL4纯化蛋白特异性鉴定 | 第104-105页 |
| ·Western blot结果 | 第104页 |
| ·ELISA结果 | 第104-105页 |
| ·SEG蛋白与质粒pRNATU6.3-shRNA最佳比例测定结果 | 第105页 |
| ·SEG蛋白与质粒pRNATU6.3-shRNA复合物接入病毒感染细胞结果 | 第105-107页 |
| ·BHK-21细胞中GFP观察 | 第105-106页 |
| ·直接免疫荧光抗体检测结果 | 第106-107页 |
| 3 讨论 | 第107-109页 |
| 参考文献 | 第109-111页 |
| 第四章 小鼠感染模型体内SEG-shRNA抑制狂犬病毒复制研究 | 第111-127页 |
| 1 材料 | 第112-113页 |
| ·质粒、siRNA与病毒 | 第112页 |
| ·实验动物 | 第112-113页 |
| ·主要试剂 | 第113页 |
| ·主要仪器与设备 | 第113页 |
| 2 方法 | 第113-118页 |
| ·狂犬病毒CVS-24株小鼠动物模型的建立 | 第113-116页 |
| ·狂犬病病毒CVS-24株小鼠脑毒的制备 | 第113页 |
| ·狂犬病病毒CVS-4株小鼠肌肉注射半数致死量(LD_(50))的测定 | 第113-114页 |
| ·小鼠脑组织压片的狂犬病直接免疫荧光检测(DFA) | 第114-115页 |
| ·小鼠脑组织狂犬病病毒核蛋白基因的RT-PCR检测 | 第115页 |
| ·小鼠脑组织狂犬病毒胶体金检测 | 第115-116页 |
| ·SEG体内靶向转运shRNA能力的检测 | 第116页 |
| ·SEG.shRNA复合物在体内的抗病毒作用检测 | 第116-117页 |
| ·小鼠脑组织的收集和处理 | 第116页 |
| ·qRT-PCR、RT-PCR检测体内RV病毒RNA水平 | 第116页 |
| ·Western blot检测脑组织中RV N蛋白含量 | 第116-117页 |
| ·免疫荧光染色法(DFA)检测脑组织中RV | 第117页 |
| ·小鼠血清IFN-α水平的检测 | 第117页 |
| ·统计学处理 | 第117-118页 |
| 3 结果 | 第118-123页 |
| ·建立狂犬病病毒CV-24株小鼠动物模型 | 第118-119页 |
| ·狂犬病病毒CVS-24株小鼠肌肉注射的半数致死量(LD_(50)) | 第118页 |
| ·DFA法检测结果 | 第118页 |
| ·RT-PCR法检测结果 | 第118页 |
| ·胶体金检测结果 | 第118-119页 |
| ·shRNA在狂犬病毒感染鼠体内的靶向运送结果 | 第119页 |
| ·SEG-shRNA在体内的抗病毒作用检测结果 | 第119-122页 |
| ·qRT-PCR和RT-PCR检测体内病毒RNA的水平结果 | 第119-120页 |
| ·Western blot检测脑组织中RVN蛋白含量的结果 | 第120-121页 |
| ·免疫荧光染色检测脑组织中RV含量变化结果 | 第121-122页 |
| ·动物生存率的观察 | 第122页 |
| ·动物体内IFN-α水平 | 第122-123页 |
| 4 讨论 | 第123-126页 |
| ·关于狂犬病感染与发病动物模型的建立 | 第123页 |
| ·SEG-shRNA复合物可实现靶向感染细胞运送shRNA | 第123-124页 |
| ·使用SEG-shRNA的优点 | 第124-125页 |
| ·下一步研究的方向 | 第125-126页 |
| 参考文献 | 第126-127页 |
| 结论 | 第127-128页 |
| 致谢 | 第128-129页 |
| 中英文缩略词表 | 第129-131页 |
| 导师简介 | 第131-132页 |
| 个人简介 | 第132-135页 |
