| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 前言 | 第13-35页 |
| 1.1 天然免疫系统 | 第13-18页 |
| 1.1.1 免疫系统简介 | 第13页 |
| 1.1.2 天然免疫抗病毒的主要途径简介 | 第13-15页 |
| 1.1.3 RLRs介导的抗病毒信号通路 | 第15-18页 |
| 1.2 RIG-I信号通路的介绍 | 第18-25页 |
| 1.2.1 RIG-I蛋白的介绍 | 第18-19页 |
| 1.2.2 RIG-I识别的配体 | 第19-20页 |
| 1.2.3 RIG-I的信号转导 | 第20-21页 |
| 1.2.4 RIG-I的调控机制 | 第21-25页 |
| 1.2.4.1 RIG-I的自抑制作用 | 第21-22页 |
| 1.2.4.2 RIG-I的转译后调控 | 第22-25页 |
| 1.3 TRIM25蛋白及其在RIG-I信号通路中的功能 | 第25-28页 |
| 1.3.1 TRIM蛋白家族 | 第25-27页 |
| 1.3.2 TRIM25参与的RIG-I信号通路的调控 | 第27-28页 |
| 1.4 结构生物学 | 第28-34页 |
| 1.4.1 结构生物学简介 | 第28-29页 |
| 1.4.2 X射线晶体学 | 第29-31页 |
| 1.4.2.1 X射线简介 | 第29页 |
| 1.4.2.2 蛋白质纯化,结晶及优化 | 第29-31页 |
| 1.4.3 核磁共振技术在蛋白结构域功能研究中的应用 | 第31-34页 |
| 1.4.3.1 核磁共振简介 | 第31页 |
| 1.4.3.2 NMR原理 | 第31-33页 |
| 1.4.3.3 NMR研究蛋白与配体间的相互作用 | 第33-34页 |
| 1.5 本课题的研究背景及意义 | 第34-35页 |
| 2 实验材料与方法 | 第35-52页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-41页 |
| 2.1.1 主要试剂 | 第35-36页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第36-37页 |
| 2.1.3 质粒、菌株及细胞 | 第37页 |
| 2.1.4 常用试剂的制备 | 第37-41页 |
| 2.1.4.1 克隆相关试剂 | 第37-39页 |
| 2.1.4.2 感受态细胞制备相关试剂 | 第39页 |
| 2.1.4.3 SDS-PAGE蛋白电泳试剂 | 第39页 |
| 2.1.4.4 细菌培养及蛋白表达相关试剂 | 第39-40页 |
| 2.1.4.5 蛋白质纯化所用试剂及缓冲液 | 第40-41页 |
| 2.2 实验方法 | 第41-52页 |
| 2.2.1 分子克隆相关实验和方法 | 第41-45页 |
| 2.2.1.1 引物设计 | 第41页 |
| 2.2.1.2 PCR扩增目的片段 | 第41-42页 |
| 2.2.1.3 双酶切载体 | 第42页 |
| 2.2.1.4 DNA片段的回收和纯化 | 第42-43页 |
| 2.2.1.5 LIC法构建表达质粒 | 第43页 |
| 2.2.1.6 定点突变 | 第43-44页 |
| 2.2.1.7 大肠杆菌感受态的制备 | 第44页 |
| 2.2.1.8 转化 | 第44-45页 |
| 2.2.1.9 碱裂解法提取质粒 | 第45页 |
| 2.2.2 重组蛋白的表达 | 第45-47页 |
| 2.2.2.1 重组蛋白的小量表达测试 | 第45-46页 |
| 2.2.2.2 重组蛋白的大量表达 | 第46页 |
| 2.2.2.3 重组目的蛋白的单一营养型M9培养基培养 | 第46-47页 |
| 2.2.3 重组蛋白的纯化 | 第47-48页 |
| 2.2.3.1 亲和纯化 | 第47-48页 |
| 2.2.3.2 凝胶过滤层析纯化 | 第48页 |
| 2.2.4 动态光散射法检测蛋白质状态 | 第48-49页 |
| 2.2.5 蛋白的结晶 | 第49-50页 |
| 2.2.5.1 结晶条件的初筛 | 第49页 |
| 2.2.5.2 结晶条件的优化 | 第49-50页 |
| 2.2.6 核磁共振技术(NMR)相关实验方法 | 第50-51页 |
| 2.2.6.1 蛋白稳定性测试 | 第50页 |
| 2.2.6.2 核磁共振相关实验 | 第50页 |
| 2.2.6.3 核磁共振化学位移扰动实验 | 第50-51页 |
| 2.2.7 免疫共沉淀及Western Blot | 第51-52页 |
| 3 实验结果与分析 | 第52-73页 |
| 3.1 CARDs与TRIM25 PRYSPRY的相互作用 | 第52-64页 |
| 3.1.1 RIG-I CARDs的表达与纯化 | 第52-54页 |
| 3.1.2 TRIM25 PRYSPRY的表达与纯化 | 第54-56页 |
| 3.1.3 Ubiquitin的表达与纯化 | 第56-57页 |
| 3.1.4 RIG-I CARDs与TRIM25 PRYSPRY的共结晶实验 | 第57页 |
| 3.1.5 RIG-I CARDs与TRIM25 PRYSPRY的相互滴定实验 | 第57-64页 |
| 3.1.5.1 蛋白在M9中的表达与纯化 | 第57-58页 |
| 3.1.5.2 RIG-I CARDs滴定~(15)N标记的TRIM25 PRYSPRY实验 | 第58-61页 |
| 3.1.5.3 免疫共沉淀实验及Western Blot | 第61-63页 |
| 3.1.5.4 TRIM25 PRYSPRY滴定~(15)N标记的RIG-I CARDs实验 | 第63-64页 |
| 3.2 RIG-I CARD2与TRIM25 PRYSPRY的相互作用 | 第64-68页 |
| 3.2.1 RIG-I CARD2的表达与纯化 | 第64-66页 |
| 3.2.2 RIG-I CARD2与TRIM25 PRYSPRY的共结晶实验 | 第66页 |
| 3.2.3 RIG-I CARD2与TRIM25 PRYSPRY的相互滴定实验 | 第66-68页 |
| 3.3 RIG-I CARD1的~1H-~(15)N相关HSQC谱 | 第68-73页 |
| 3.3.1 RIG-I CARD1的表达与纯化 | 第68-70页 |
| 3.3.2 RIG-I CARD1动态光散射实验 | 第70-71页 |
| 3.3.3 RIG-I CARD1的~1H-~(15)N相关HSQC谱采集 | 第71-73页 |
| 4 总结 | 第73-76页 |
| 参考文献 | 第76-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
