| 摘要 | 第8-11页 |
| Abstract | 第11-14页 |
| 缩略词表 | 第15-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-28页 |
| 1 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA) | 第17-21页 |
| 1.1 ALA简介 | 第17页 |
| 1.2 ALA的两种生物合成途径 | 第17-18页 |
| 1.3 ALA C5合成途径的调控 | 第18-19页 |
| 1.4 5-氨基乙酰丙酸合成研究背景及进展 | 第19-21页 |
| 1.4.1 利用C4途径生产ALA | 第19-20页 |
| 1.4.2 利用C5途径生产ALA | 第20-21页 |
| 2 血红素 | 第21-23页 |
| 2.1 血红素的生物功能 | 第21页 |
| 2.2 大肠杆菌中血红素的生物合成途径 | 第21-23页 |
| 3 sRNA RyhB | 第23-26页 |
| 3.1 sRNA简介 | 第23-24页 |
| 3.2 RyhB | 第24-26页 |
| 5 本论文的研究内容与意义 | 第26-28页 |
| 第二章 代谢工程改造血红素合成途径提高ALA产量 | 第28-71页 |
| 1 引言 | 第28页 |
| 2 实验材料 | 第28-36页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第28-30页 |
| 2.2 引物 | 第30-32页 |
| 2.3 常用的生化试剂 | 第32页 |
| 2.4 常用的试剂盒 | 第32页 |
| 2.5 常用的工具酶 | 第32-33页 |
| 2.6 培养基与主要试剂 | 第33-36页 |
| 2.6.1 培养基与相关试剂 | 第33-34页 |
| 2.6.2 主要试剂及缓冲液 | 第34-36页 |
| 3 实验方法 | 第36-50页 |
| 3.1 菌种及质粒等核酸片段的保藏 | 第36页 |
| 3.2 分子生物学实验常规操作 | 第36-42页 |
| 3.2.1 PCR扩增 | 第37-38页 |
| 3.2.2 PCR产物的回收 | 第38页 |
| 3.2.3 质粒DNA提取 | 第38-39页 |
| 3.2.4 大肠杆菌基因组DNA提取 | 第39页 |
| 3.2.5 琼脂糖凝胶中DNA产物的回收 | 第39页 |
| 3.2.6 大肠杆菌DH5α化学感受态细胞的制备 | 第39页 |
| 3.2.7 限制性内切酶酶切目的片段和载体 | 第39-40页 |
| 3.2.8 体外连接目的片段和载体 | 第40页 |
| 3.2.9 大肠杆菌的常规转化(化学转化法) | 第40页 |
| 3.2.10 重组子的筛选与鉴定 | 第40-42页 |
| 3.3 大肠杆菌DH5α中arcA基因的敲除 | 第42-44页 |
| 3.3.1 同源重组片段的克隆 | 第42页 |
| 3.3.2 电转化感受态细胞的制备 | 第42页 |
| 3.3.3 电转化同源重组片段 | 第42-43页 |
| 3.3.4 重组子的筛选与鉴定 | 第43页 |
| 3.3.5 质粒pKD46的去除 | 第43页 |
| 3.3.6 去除大肠杆菌DH5αΔarcA菌株中卡那霉素抗性基因 | 第43-44页 |
| 3.4 质粒与菌株的构建 | 第44-45页 |
| 3.4.1 在pDAL质粒上过表达rhtA和eamA基因质粒与菌株的构建 | 第44页 |
| 3.4.2 在pCL1920质粒上过表达eamA基因质粒与菌株的构建 | 第44页 |
| 3.4.3 在pCL1920质粒上过表达来自嗜酸性亚铁硫杆菌的gltX1和gltX基因质粒与菌株的构建 | 第44-45页 |
| 3.4.4 在pCL1920质粒上过表达来自慢生根瘤菌的irr基因质粒与菌株的构建 | 第45页 |
| 3.5 ALA的发酵方法 | 第45-46页 |
| 3.5.1 种子培养 | 第45页 |
| 3.5.2 摇瓶发酵 | 第45-46页 |
| 3.5.3 发酵罐培养 | 第46页 |
| 3.6 检测方法 | 第46-47页 |
| 3.6.1 ALA的检测方法 | 第46-47页 |
| 3.6.2 葡萄糖浓度的测定 | 第47页 |
| 3.6.3 细菌生长情况检测 | 第47页 |
| 3.5.4 发酵代谢副产物的检测 | 第47页 |
| 3.7 荧光定量PCR | 第47-50页 |
| 3.7.1 大肠杆菌总RNA提取 | 第47-48页 |
| 3.7.2 反转录获取cDNA | 第48-49页 |
| 3.7.3 荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第49-50页 |
| 4 实验结果 | 第50-69页 |
| 4.1 在pDAL质粒上过表达rhtA和eamA基因不能促进ALA的积累 | 第50-51页 |
| 4.2 在pCL1920质粒上过表达eamA基因能增加ALA的产量 | 第51-53页 |
| 4.3 在pCL1920质粒上过表达来自慢生根瘤菌的irr基因不能促进ALA的积累 | 第53-55页 |
| 4.4 敲除arcA基因能够促进ALA的积累 | 第55-56页 |
| 4.5 溶氧条件对大肠杆菌DarcAL(或DarcALA)ALA积累的影响 | 第56-67页 |
| 4.5.1 溶氧影响ALA的积累 | 第56-58页 |
| 4.5.2 大肠杆菌DarcALA的ALA发酵溶氧条件的探索 | 第58-61页 |
| 4.5.3 高溶氧水平引起基因gltX的表达下调 | 第61-67页 |
| 4.6 在pCL1920质粒上过表达来自嗜酸性亚铁硫杆菌的gltX1和gltX基因能够促进ALA的积累 | 第67-69页 |
| 5 讨论与总结 | 第69-71页 |
| 第三章 组成型表达小RNA RyhB对血红素合成途径的调控作用及对ALA产量的影响 | 第71-84页 |
| 1 引言 | 第71-72页 |
| 2 实验材料 | 第72-74页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第72-73页 |
| 2.2 引物 | 第73-74页 |
| 2.3 培养基及主要试剂 | 第74页 |
| 3 实验方法 | 第74-77页 |
| 3.1 质粒pCLRA-ryhB的构建 | 第74-75页 |
| 3.2 heme的测定方法 | 第75-77页 |
| 4 实验结果 | 第77-82页 |
| 4.1 组成型表达ryhB增加了ALA的产量,减少了heme的积累 | 第77-78页 |
| 4.2 过表达RyhB改变了代谢流,并且使含铁蛋白表达量下调 | 第78-80页 |
| 4.3 铁离子和2,2’-联吡啶对ALA产量和heme积累的影响 | 第80-82页 |
| 5 讨论与总结 | 第82-84页 |
| 第四章 转录组学分析过表达C5途径基因对大肠杆菌代谢的影响 | 第84-93页 |
| 1 引言 | 第84页 |
| 2 实验材料 | 第84-85页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第84-85页 |
| 2.2 基因芯片 | 第85页 |
| 3 实验方法 | 第85页 |
| 4 实验结果 | 第85-91页 |
| 4.1 大肠杆菌加强C5途径引起乙酸、琥珀酸和乳酸的积累降低 | 第85-88页 |
| 4.2 基因芯片结果 | 第88-91页 |
| 4.2.1 大肠杆菌加强C5途径引起乙酸产生和清除相关基因、TCA循环基因表达下调 | 第88-90页 |
| 4.2.2 大肠杆菌过表达C5途径引起呼吸链组分发生变化 | 第90-91页 |
| 5 讨论与总结 | 第91-93页 |
| 全文总结 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-104页 |
| 致谢 | 第104-106页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第106-107页 |
| 附件 | 第107-114页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第114页 |
