| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 英文缩写表 | 第6-7页 |
| 目录 | 第7-10页 |
| 第一章 前言 | 第10-23页 |
| 1.非洲猪瘟的流行趋势 | 第10-12页 |
| 2.非洲猪瘟的病理学特征 | 第12-15页 |
| 2.1 非洲猪瘟的临床特征 | 第12页 |
| 2.2 非洲猪瘟常见宿主 | 第12-14页 |
| 2.3 非洲猪瘟病的传播途径 | 第14-15页 |
| 3. 非洲猪瘟病毒形态学特征和主要组成蛋白 | 第15-16页 |
| 4.非洲猪瘟检测方法 | 第16-21页 |
| 4.1 病毒分离 | 第17页 |
| 4.2 分子生物学检测方法 | 第17-20页 |
| 4.2.1 常规 PCR | 第17-18页 |
| 4.2.2 实时定量荧光 PCR | 第18-19页 |
| 4.2.3 圆环介导的等温扩增 | 第19-20页 |
| 4.3 免疫学检测方法 | 第20-21页 |
| 4.3.1 抗原检测 | 第20页 |
| 4.3.2 抗体检测 | 第20-21页 |
| 5. 本研究的目的及意义 | 第21-22页 |
| 6. 技术路线 | 第22-23页 |
| 第二章 非洲猪瘟病毒蛋白 p54 的原核表达及间接 ELISA 方法的建立 | 第23-48页 |
| 1.实验材料 | 第23-26页 |
| 1.1 主要实验试剂和仪器 | 第23-24页 |
| 1.2 主要溶液配方 | 第24-26页 |
| 2. 实验方法 | 第26-37页 |
| 2.1 p54 原核表达载体构建 | 第26-32页 |
| 2.1.1 目的基因扩增 | 第26-27页 |
| 2.1.2 目的基因片段回收 | 第27-28页 |
| 2.1.3 目的基因与表达载体连接 | 第28-29页 |
| 2.1.4 原核表达载体的转化和鉴定 | 第29-32页 |
| 2.1.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| 2.1.4.2 阳性克隆的筛选及鉴定 | 第30-32页 |
| 2.2 大肠杆菌的诱导表达及条件优化 | 第32-33页 |
| 2.3 重组表达蛋白的纯化及 Western-blot 分析 | 第33-35页 |
| 2.3.1 重组表达蛋白的纯化 | 第33页 |
| 2.3.2 重组表达蛋白的 Western-blot 分析 | 第33-35页 |
| 2.4 间接 ELISA 方法的建立 | 第35-37页 |
| 2.4.1 包被浓度和血清稀释度的确定 | 第35页 |
| 2.4.2 ELISA 最佳反应条件的确定 | 第35-36页 |
| 2.4.3 重复性评价 | 第36页 |
| 2.4.4 阴阳性判定阈值与检测限的判定 | 第36页 |
| 2.4.5 符合率、特异性和灵敏性的评价 | 第36-37页 |
| 3 实验结果 | 第37-48页 |
| 3.1 原核表达载体的构建 | 第37-41页 |
| 3.1.1 目的基因的扩增 | 第37页 |
| 3.1.2 原核表达载体的鉴定 | 第37-38页 |
| 3.1.3 蛋白表达条件的优化 | 第38-40页 |
| 3.1.4 表达蛋白纯化的 SDS PAGE 和 Western blot 分析 | 第40-41页 |
| 3.2 间接 ELISA 方法的建立 | 第41-48页 |
| 3.2.1 最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定 | 第41-42页 |
| 3.2.3 最佳反应条件的确定 | 第42-44页 |
| 3.2.4 重复性评价 | 第44-46页 |
| 3.2.5 阴阳性判定阈值与检测限的确定 | 第46页 |
| 3.2.6 符合率、灵敏性和特异性的评价 | 第46-48页 |
| 第三章 非洲猪瘟病毒蛋白 p54 的真核表达及间接 ELISA 方法的建立 | 第48-74页 |
| 1.实验材料 | 第48-51页 |
| 1.1 主要实验试剂和仪器 | 第48-49页 |
| 1.2 主要溶液配方 | 第49-51页 |
| 2. 实验方法 | 第51-61页 |
| 2.1 真核表达载体的构建 | 第51-58页 |
| 2.1.1 目的基因的扩增 | 第51-52页 |
| 2.1.2 目的基因与载体连接 | 第52-55页 |
| 2.1.3 重组质粒的转座和鉴定 | 第55-57页 |
| 2.1.4 bacmid 的脂质化 | 第57-58页 |
| 2.1.5 重组杆状病毒的获得 | 第58页 |
| 2.2 重组蛋白的 SDS-PAGE 和 Western-blot 分析 | 第58-59页 |
| 2.3 间接 ELISA 检测方法的建立 | 第59-61页 |
| 2.3.1 最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定 | 第59页 |
| 2.3.2 ELISA 最佳反应条件的确定 | 第59-60页 |
| 2.3.3 重复性评价 | 第60页 |
| 2.3.4 阴阳性判定阈值与检测限的判定 | 第60页 |
| 2.3.5 符合率、特异性和灵敏性的评价 | 第60-61页 |
| 3. 实验结果 | 第61-74页 |
| 3.1 真核表达载体的构建 | 第61-66页 |
| 3.1.1 目的基因的扩增 | 第61页 |
| 3.1.2 真核重组载体的鉴定 | 第61-64页 |
| 3.1.3 重组杆状病毒鉴定 | 第64-65页 |
| 3.1.4 重组杆状病毒的获得 | 第65-66页 |
| 3.2 重组蛋白的 SDS-PAGE 和 Western-blot 检测 | 第66-68页 |
| 3.3 间接 ELISA 检测方法的建立 | 第68-74页 |
| 3.3.1 最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定 | 第68-69页 |
| 3.3.2 最佳反应条件的确定 | 第69-71页 |
| 3.3.3 重复性评价 | 第71-72页 |
| 3.3.4 阴阳性判定阈值与检测限的判定 | 第72页 |
| 3.3.5 符合率、灵敏性和特异性的评价 | 第72-74页 |
| 第四章 非洲猪瘟病毒蛋白 p54 单克隆抗体制备 | 第74-84页 |
| 1.实验材料 | 第74-76页 |
| 1.1 主要实验试剂和仪器 | 第74-75页 |
| 1.2 主要溶液配方 | 第75-76页 |
| 2 实验方法 | 第76-80页 |
| 2.1 抗原免疫 | 第76页 |
| 2.2 免疫小鼠的选择及免疫血清效价的测定 | 第76页 |
| 2.3 骨髓瘤细胞 SP2/0 的培养和饲养细胞的制备 | 第76-77页 |
| 2.3.1 骨髓瘤细胞 SP2/0 的培养 | 第76-77页 |
| 2.3.2 饲养细胞制备 | 第77页 |
| 2.4 小鼠脾细胞与 SP2/0 细胞融合 | 第77-78页 |
| 2.4.1 小鼠脾细胞的获取 | 第77-78页 |
| 2.4.2 细胞融合 | 第78页 |
| 2.5 杂交瘤细胞的筛选及克隆 | 第78-79页 |
| 2.6 细胞建株 | 第79页 |
| 2.7 腹水型单抗制备 | 第79-80页 |
| 3 实验结果 | 第80-84页 |
| 3.1 免疫小鼠的选择及免疫血清效价的测定 | 第80页 |
| 3.1.1 免疫小鼠的选择 | 第80页 |
| 3.1.2 免疫血清效价测定 | 第80页 |
| 3.2 杂交瘤细胞的筛选 | 第80-81页 |
| 3.3 腹水型单抗的制备及纯化 | 第81-84页 |
| 第五章 小结与讨论 | 第84-87页 |
| 1. 小结 | 第84页 |
| 2. 讨论 | 第84-87页 |
| 参考文献 | 第87-91页 |
| 在读期间发表论文和学术交流情况 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92页 |
