| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩写词表 | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-39页 |
| 1 前言 | 第13-14页 |
| 2 紫杉醇的简介 | 第14-15页 |
| 3 紫杉醇的抗癌机理 | 第15页 |
| 4 紫杉醇的生物合成 | 第15-21页 |
| 4.1 所有萜类合成前体物质IPP的合成 | 第16-17页 |
| 4.2 二萜类物质合成前体GGPP的合成 | 第17-18页 |
| 4.3 紫杉醇母核的合成 | 第18-20页 |
| 4.4 紫杉醇侧链的修饰 | 第20-21页 |
| 5 紫杉醇途径中关键酶 | 第21-24页 |
| 5.1 紫杉二烯合酶 | 第22-23页 |
| 5.2 细胞色素P450单加氧酶 | 第23-24页 |
| 5.3 酰基转移酶类 | 第24页 |
| 6 紫杉醇的来源 | 第24-27页 |
| 6.1 植物提取 | 第24-25页 |
| 6.2 化学全合成 | 第25页 |
| 6.3 化学半合成 | 第25-26页 |
| 6.4 植物细胞培养 | 第26页 |
| 6.5 微生物发酵 | 第26-27页 |
| 7 产紫杉醇内生真菌 | 第27-35页 |
| 7.1 产紫杉醇内生真菌的分离情况 | 第27-32页 |
| 7.2 提高产紫杉醇内生真菌产量的基本途径 | 第32-35页 |
| 7.2.1 优化发酵培养条件 | 第33-34页 |
| 7.2.2 菌种改良 | 第34-35页 |
| 8 丝状真菌的遗传转化 | 第35-38页 |
| 8.1 聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)介导转化法 | 第35页 |
| 8.2 醋酸锂(Lithium Acetate)转化法 | 第35-36页 |
| 8.3 电穿孔(Electroporation)转化法 | 第36页 |
| 8.4 微弹轰击(Biolistics)转化法 | 第36页 |
| 8.5 限制性内切酶介导整合法(Restriction Enzyme Mediated Integration,REMI) | 第36-37页 |
| 8.6 根癌农杆菌介导转化法(Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation,ATMT) | 第37-38页 |
| 9 本课题的研究意义 | 第38-39页 |
| 第二章 红豆杉产紫杉烷类化合物内生真菌的分离与鉴定 | 第39-69页 |
| 1 材料与试剂 | 第39-42页 |
| 1.1 植物材料 | 第39页 |
| 1.2 培养基 | 第39-40页 |
| 1.3 菌株和载体 | 第40页 |
| 1.4 试剂 | 第40页 |
| 1.5 试剂配制 | 第40-41页 |
| 1.6 仪器和设备 | 第41-42页 |
| 2 实验方法 | 第42-53页 |
| 2.1 红豆杉内生真菌的分离 | 第42页 |
| 2.2 红豆杉内生真菌的发酵培养及紫杉醇烷类化合物的提取检测 | 第42-44页 |
| 2.2.1 红豆杉内生真菌的发酵培养 | 第42-43页 |
| 2.2.2 真菌发酵紫杉烷类物质的提取 | 第43-44页 |
| 2.2.3 发酵液的检测 | 第44页 |
| 2.3 真菌菌丝体及孢子的形态学观察 | 第44-45页 |
| 2.4 真菌的分子生物学鉴定 | 第45-51页 |
| 2.4.1 真菌基因组DNA的提取 | 第45-46页 |
| 2.4.2 通用引物的选择和反应条件的确定 | 第46-48页 |
| 2.4.3 PCR产物的胶回收 | 第48-49页 |
| 2.4.4 PCR片断与pMD18 Tsimple载体的连接 | 第49页 |
| 2.4.5 大肠肝菌DH5α感受态细胞的制备 | 第49页 |
| 2.4.6 连接产物转化大肠肝菌DH5α | 第49-50页 |
| 2.4.7 转化子的检测 | 第50页 |
| 2.4.8 阳性转化子的质粒抽提 | 第50-51页 |
| 2.5 真菌的培养条件优化 | 第51-53页 |
| 2.5.1 红豆杉产巴卡亭Ⅲ内生真菌TL9的生长曲线研究 | 第51页 |
| 2.5.2 TL9内生真菌培养条件的优化 | 第51-53页 |
| 3 结果与讨论 | 第53-68页 |
| 3.1 红豆杉内生真菌的分离 | 第53页 |
| 3.2 内生真菌发酵产物的检测 | 第53-55页 |
| 3.3 真菌形态学鉴定 | 第55-56页 |
| 3.4 产巴卡亭Ⅲ内生真菌TL9的分子生物学鉴定 | 第56-64页 |
| 3.4.1 内生真菌的基因组DNA提取结果 | 第56页 |
| 3.4.2 ITS序列的扩增 | 第56-57页 |
| 3.4.3 18S rDNA序列的扩增 | 第57-60页 |
| 3.4.4 基于ITS序列和18S rDNA序列的进化树分析 | 第60-64页 |
| 3.5 真菌TL9的培养条件优化 | 第64-68页 |
| 3.5.1 TL9生长曲线的绘制 | 第64-65页 |
| 3.5.2 培养基的条件优化 | 第65-68页 |
| 4 小结 | 第68-69页 |
| 第三章 TL9真菌10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-乙酰转移酶(DBAT)基因的克隆 | 第69-83页 |
| 1 材料与试剂 | 第69-70页 |
| 1.1 菌株和载体 | 第69页 |
| 1.2 试剂 | 第69-70页 |
| 1.3 仪器设备 | 第70页 |
| 2 试验方法 | 第70-75页 |
| 2.1 产紫杉醇内生真菌基因组DNA的提取 | 第70页 |
| 2.2 dbat基因核心片断的克隆 | 第70-72页 |
| 2.3 dbat基因核心片断两侧序列的克隆 | 第72-75页 |
| 2.3.1 基因组DNA的酶切 | 第73页 |
| 2.3.2 酶切产物的纯化 | 第73页 |
| 2.3.3 酶切片断的自我环化 | 第73页 |
| 2.3.4 第一轮PCR | 第73-74页 |
| 2.3.5 第二轮PCR | 第74-75页 |
| 3 结果与讨论 | 第75-82页 |
| 3.1 基因组DNA的提取 | 第75-76页 |
| 3.2 产紫杉醇内生真菌dbat基因核心片段的克隆 | 第76-77页 |
| 3.3 反向PCR克隆核心片段两侧序列 | 第77-82页 |
| 4 小结 | 第82-83页 |
| 第四章 真菌TL9原生质体制备以及根癌农杆菌介导的原生质体转化平台建立 | 第83-108页 |
| 1 材料与试剂 | 第83-85页 |
| 1.1 酶及试剂 | 第83-84页 |
| 1.2 菌株 | 第84页 |
| 1.3 仪器和设备 | 第84-85页 |
| 2 实验方法 | 第85-95页 |
| 2.1 原生质体的制备 | 第85-87页 |
| 2.1.1 渗透压稳定剂的确定 | 第85-86页 |
| 2.1.2 原生质体的制备流程 | 第86页 |
| 2.1.3 原生质体活力检测 | 第86-87页 |
| 2.1.4 原生质体的再生实验 | 第87页 |
| 2.2 根癌农杆菌介导的原生质体转化 | 第87-95页 |
| 2.2.1 真菌潮霉素抗性表达质粒的构建 | 第87-89页 |
| 2.2.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第89页 |
| 2.2.3 根癌农杆菌的质粒转化 | 第89-90页 |
| 2.2.4 根癌农杆菌(Hyg~+)预培养 | 第90页 |
| 2.2.5 根癌农杆菌(Hyg~+)的诱导培养 | 第90页 |
| 2.2.6 根癌农杆菌(Hyg~+)介导的原生质体的转化 | 第90页 |
| 2.2.7 潮霉素抗性转化子的筛选培养及稳定性遗传 | 第90-91页 |
| 2.2.8 潮霉素抗性转化子的PCR检测 | 第91页 |
| 2.2.9 潮霉素抗性转化子的Southern blot检测 | 第91-95页 |
| 3 结果与讨论 | 第95-107页 |
| 3.1 原生质体的制备条件的优化 | 第95-97页 |
| 3.1.1 最佳酶解温度的确定 | 第95-96页 |
| 3.1.2 最佳酶解时间的确定 | 第96页 |
| 3.1.3 原生质体的制备结果 | 第96-97页 |
| 3.2 潮霉素表达载体的构建 | 第97-99页 |
| 3.3 潮霉素浓度的筛选压确定 | 第99-100页 |
| 3.4 原生质体培养支持物的选择 | 第100页 |
| 3.5 根癌农杆菌菌种的影响 | 第100-101页 |
| 3.6 AS添加方式的影响 | 第101-102页 |
| 3.7 AS添加浓度的影响 | 第102-103页 |
| 3.8 原生质体浓度的影响 | 第103页 |
| 3.9 农杆菌菌液浓度的影响 | 第103-104页 |
| 3.10 共培养条件的影响 | 第104-106页 |
| 3.11 潮霉素抗性遗传稳定性结果 | 第106页 |
| 3.12 潮霉素抗性转化子的PCR验证 | 第106-107页 |
| 3.13 Southern blot实验结果 | 第107页 |
| 4 小结 | 第107-108页 |
| 第五章 关键酶基因的真菌表达载体构建 | 第108-128页 |
| 1 材料与试剂 | 第108页 |
| 1.1 菌株和载体 | 第108页 |
| 1.2 相关酶和试剂 | 第108页 |
| 2 功能基因构建思路 | 第108-110页 |
| 3 实验方法 | 第110-120页 |
| 3.1 红豆杉叶片RNA的提取 | 第110-111页 |
| 3.2 红豆杉ts基因、dbat基因、bapt基因以及启动子序列的克隆 | 第111-114页 |
| 3.3 bapt基因的点突变 | 第114-117页 |
| 3.3.1 突变引物的设计 | 第114-115页 |
| 3.3.2 点突变实验步骤 | 第115-117页 |
| 3.4 中间载体的构建 | 第117-118页 |
| 3.4.1 pMD18 T simple+promoter序列载体XbaⅠ和AflⅡ双酶切 | 第117页 |
| 3.4.2 pMD18 T simple+ts基因,dbat基因,bapt基因XbaⅠ和AflⅡ双酶切 | 第117-118页 |
| 3.4.3 将pMD18 T simple+promoter载体双酶切后回收的大片段分别与pMD18T simple+ts基因,dbat基因,bapt基因载体双酶切胶回收的关键酶基因片段相连接 | 第118页 |
| 3.5 关键酶基因的真菌表达载体构建 | 第118-120页 |
| 3.5.1 pCAMBIA1304'-pAN7-1质粒的SpeⅠ和AflⅡ双酶切 | 第119页 |
| 3.5.2 pMD18 T simple+gpdA promoter+ts,dbat,bapt的SpeⅠ和AflⅡ双酶切 | 第119页 |
| 3.5.3 相应片段的连接 | 第119-120页 |
| 4 结果与讨论 | 第120-127页 |
| 4.1 RNA的提取结果 | 第120页 |
| 4.2 ts,dbat,bapt基因的RT-PCR结果 | 第120-121页 |
| 4.3 ts,dbat,bapt基因与pMD18 T simple载体相连接 | 第121-122页 |
| 4.4 gpdA基因启动子的克隆 | 第122-123页 |
| 4.5 bapt基因点突变的实验结果 | 第123-125页 |
| 4.6 中间载体的构建结果 | 第125-126页 |
| 4.7 功能基因表达载体的构建 | 第126-127页 |
| 5 小结 | 第127-128页 |
| 第六章 产巴卡亭Ⅲ内生真菌的紫杉醇合成途径功能基因的遗传转化 | 第128-145页 |
| 1 材料与试剂 | 第128-129页 |
| 1.1 菌种 | 第128页 |
| 1.2 试剂 | 第128页 |
| 1.3 仪器与设备 | 第128-129页 |
| 2 实验方法 | 第129-136页 |
| 2.1 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备 | 第129页 |
| 2.2 质粒pTS,pDBAT,pBAPT转化根癌农杆菌EHA105 | 第129页 |
| 2.3 根癌农杆菌EHA105(pTS),EHA105(pDBAT),EHA105 (pBAPT)的预培养 | 第129页 |
| 2.4 根癌农杆菌EHA105(pTS),EHA105(pDBAT),EHA105(pBAPT)的诱导培养 | 第129-130页 |
| 2.5 真菌TL9的原生质体制备 | 第130页 |
| 2.6 根癌农杆菌EHA105(pTS),EHA105(pDBAT),EHA105(pBAPT)转化真菌TL9的原生质体 | 第130页 |
| 2.7 潮霉素抗性转化子的纯培养 | 第130页 |
| 2.8 阳性转化子的基因组DNA提取 | 第130页 |
| 2.9 阳性转化子的PCR检测 | 第130-133页 |
| 2.10 真菌的发酵培养和紫杉烷类化合物的提取 | 第133页 |
| 2.11 HPLC-MS检测真菌发酵产物 | 第133页 |
| 2.12 阳性转化子的Southern Blot检测 | 第133页 |
| 2.13 真菌的基因表达量分析 | 第133-136页 |
| 2.13.1 真菌RNA的提取 | 第133-136页 |
| 2.13.2 半定量RT-PCR检测dbat基因的表达情况 | 第136页 |
| 3 结果与讨论 | 第136-144页 |
| 3.1 根癌农杆菌EHA105(pTS),EHA105(pDBAT),EHA105(pBAPT)的菌液PCR验证 | 第136-137页 |
| 3.2 功能基因载体转化真菌TL9原生质体 | 第137页 |
| 3.3 真菌转化子的PCR验证 | 第137-138页 |
| 3.4 真菌RNA的提取 | 第138-140页 |
| 3.5 转化子的次生代谢产物含量HPLC-MS分析 | 第140-143页 |
| 3.6 转dbat基因转化子的基因表达量分析 | 第143页 |
| 3.7 阳性转化子的Southern Blot分析 | 第143-144页 |
| 4 小结 | 第144-145页 |
| 第七章 总结与展望 | 第145-148页 |
| 1 总结 | 第145-146页 |
| 2 论文创新点 | 第146-147页 |
| 3 展望 | 第147-148页 |
| 参考文献 | 第148-164页 |
| 攻读博士学位期间发表文章 | 第164-165页 |
| 致谢 | 第165-166页 |
