| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-8页 |
| 第一部分 前言 | 第8-24页 |
| 1 真核细胞泛素介导的蛋白降解途径概述 | 第8-9页 |
| ·真核细胞蛋白降解过程 | 第8-9页 |
| ·真核细胞蛋白酶体 | 第9页 |
| 2 原核细胞蛋白类泛素降解途径概述 | 第9-17页 |
| ·原核蛋白酶体的研究 | 第9-11页 |
| ·类泛素蛋白Pup序列及结构特征 | 第11-13页 |
| ·蛋白酶体辅助因子 | 第13-14页 |
| ·去酰胺酶Dop | 第13页 |
| ·连接酶PafA | 第13-14页 |
| ·Pup介导的蛋白质降解过程 | 第14-15页 |
| ·Pup-蛋白酶系统的靶蛋白及其功能 | 第15-16页 |
| ·真核生物和原核生物蛋白酶体系统的比较 | 第16-17页 |
| 3 重组蛋白技术概述 | 第17-21页 |
| ·重组质粒的构建 | 第18-19页 |
| ·目的基因的获得 | 第18页 |
| ·重组质粒构建 | 第18-19页 |
| ·纯化及检测标签的选择 | 第19页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第19页 |
| ·重组蛋白质折叠概述 | 第19-20页 |
| ·蛋白质结构概述 | 第20-21页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第21页 |
| ·重组蛋白的检测 | 第21页 |
| 4 多克隆抗体技术概述 | 第21-22页 |
| 5 基因敲除技术概述 | 第22-23页 |
| 6 研究的目的和意义 | 第23-24页 |
| 第二部分 实验材料和方法 | 第24-43页 |
| 1 实验材料 | 第24-27页 |
| ·生物材料 | 第24页 |
| ·实验仪器 | 第24页 |
| ·试剂、技术支持 | 第24-25页 |
| ·相关溶液配制 | 第25-27页 |
| 2 实验方法 | 第27-43页 |
| ·目的基因的获得 | 第27-29页 |
| ·引物设计 | 第27-28页 |
| ·基因克隆 | 第28-29页 |
| ·重组质粒的构建 | 第29-33页 |
| ·重组质粒的转化 | 第33页 |
| ·Pup蛋白的诱导表达与纯化 | 第33-36页 |
| ·Pup蛋白的诱导表达 | 第33-34页 |
| ·Pup蛋白的纯化 | 第34页 |
| ·Pup多克隆抗体的制备 | 第34-35页 |
| ·Pup蛋白的酶切与检测 | 第35-36页 |
| ·Dop、FabD和PafA蛋白的诱导表达和纯化 | 第36-38页 |
| ·Dop蛋白的表达和纯化 | 第36-37页 |
| ·FabD蛋白的表达和纯化 | 第37-38页 |
| ·PafA蛋白的表达和纯化 | 第38页 |
| ·耻垢分枝杆菌dop基因敲除的初步试验 | 第38-43页 |
| ·耻垢分枝杆菌基因组的提取 | 第38-39页 |
| ·目的基因克隆 | 第39-41页 |
| ·pKO穿梭敲除质粒的构建 | 第41-42页 |
| ·耻垢分枝杆菌感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·穿梭质粒的电转化 | 第42页 |
| ·敲除菌株的筛选 | 第42-43页 |
| 第三部分 实验结果 | 第43-65页 |
| 1 基因分析和蛋白序列分析 | 第43-52页 |
| ·pup基因的优化分析 | 第43-44页 |
| ·Pup蛋白的序列分析 | 第44-45页 |
| ·Dop蛋白的序列分析 | 第45-48页 |
| ·FabD蛋白的序列分析 | 第48-50页 |
| ·PafA蛋白的序列分析 | 第50-52页 |
| 2 重组质粒构建结果 | 第52-54页 |
| ·pGEX-2T-his_6-pup重组质粒构建结果 | 第52-53页 |
| ·pET21cc-dop重组质粒构建结果 | 第53页 |
| ·pET21cc-fabD重组质粒构建结果 | 第53-54页 |
| ·pET21cc-pafA和pBAD-pafA重组质粒构建结果 | 第54页 |
| 3 蛋白诱导表达纯化结果 | 第54-63页 |
| ·Pup蛋白表达、纯化和酶切 | 第54-57页 |
| ·Pup蛋白表达结果 | 第54-55页 |
| ·Pup蛋白纯化结果 | 第55-56页 |
| ·GST-His_6-Pup蛋白酶切结果 | 第56页 |
| ·GST-His_6-Pup蛋白免疫印迹结果 | 第56-57页 |
| ·Dop蛋白表达与纯化 | 第57-59页 |
| ·Dop蛋白表达结果 | 第57-58页 |
| ·Dop蛋白纯化结果 | 第58-59页 |
| ·Dop蛋白免疫印迹结果 | 第59页 |
| ·FabD蛋白的表达和纯化 | 第59-61页 |
| ·FabD蛋白的表达结果 | 第59-60页 |
| ·FabD蛋白的纯化结果 | 第60页 |
| ·FabD蛋白的免疫印迹结果 | 第60-61页 |
| ·PafA蛋白的表达与纯化 | 第61-63页 |
| ·PafA蛋白表达结果 | 第61-63页 |
| ·PafA蛋白纯化结果 | 第63页 |
| 4 dop基因敲除的初步结果 | 第63-65页 |
| ·pKO穿梭质粒的构建结果 | 第63-64页 |
| ·敲除菌株的筛选结果 | 第64-65页 |
| 第四部分 结论与展望 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-71页 |
| 个人简介 | 第71-72页 |
| 导师简介 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |