| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 1 背景介绍 | 第15-29页 |
| 1.1 前言 | 第15页 |
| 1.2 EGFR的结构和功能 | 第15-16页 |
| 1.3 EGFR突变状态和EGFR-TKI的作用机制 | 第16-17页 |
| 1.4 EGFR-TKI的耐药机制 | 第17-22页 |
| 1.4.1 原发性耐药机制 | 第17-18页 |
| 1.4.2 获得性耐药机制 | 第18-22页 |
| 1.5 肿瘤与代谢 | 第22-26页 |
| 1.5.1 “Warburg效应”学说 | 第22-23页 |
| 1.5.2 肿瘤细胞代谢特点—有氧糖酵解 | 第23-24页 |
| 1.5.3 肿瘤细胞代谢另一特点—消耗大量谷氨酰胺 | 第24-25页 |
| 1.5.4 抑制能量代谢杀灭肿瘤细胞 | 第25-26页 |
| 1.6 代谢组学及其应用 | 第26-27页 |
| 1.7 本研究目的和意义 | 第27-29页 |
| 2 实验材料 | 第29-35页 |
| 2.1 细胞系 | 第29页 |
| 2.2 实验动物 | 第29页 |
| 2.3 药品 | 第29页 |
| 2.4 主要试剂 | 第29-30页 |
| 2.5 主要仪器设备 | 第30-31页 |
| 2.6 主要缓冲液配制 | 第31-35页 |
| 3 实验方法 | 第35-51页 |
| 3.1 细胞培养 | 第35页 |
| 3.2 EGFR突变状态的检测 | 第35-38页 |
| 3.2.1 细胞中基因组DNA提取 | 第36页 |
| 3.2.2 DNA定量 | 第36页 |
| 3.2.3 PCR扩增 | 第36-38页 |
| 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第38页 |
| 3.2.5 测序 | 第38页 |
| 3.3 耐药细胞株的建立 | 第38-40页 |
| 3.3.1 MTT法检测埃克替尼对细胞活性的影响 | 第38-39页 |
| 3.3.2 埃克替尼对细胞克隆形成能力的检测 | 第39页 |
| 3.3.3 检测埃克替尼对细胞凋亡的影响 | 第39页 |
| 3.3.4 耐药细胞株的诱导 | 第39-40页 |
| 3.4 耐药细胞株的鉴定 | 第40-47页 |
| 3.4.1 耐药细胞株耐药指数的测定 | 第40页 |
| 3.4.2 耐药稳定性的检测 | 第40页 |
| 3.4.3 耐药细胞株形态学的观察 | 第40页 |
| 3.4.4 EGFR T790M突变状态检测 | 第40-41页 |
| 3.4.5 Real-time PCR检测EGFR及其旁路信号相关分子表达 | 第41-43页 |
| 3.4.6 Western blot检测EGFR及其旁路信号相关分子磷酸化及总蛋白表达 | 第43-46页 |
| 3.4.7 PC-9/IR耐药细胞株皮下移植瘤模型的建立 | 第46-47页 |
| 3.5 不同细胞株代谢差异物的分析 | 第47-49页 |
| 3.5.1 样本收集 | 第47页 |
| 3.5.2 样本制备 | 第47-48页 |
| 3.5.3 采集核磁数据参数 | 第48-49页 |
| 3.5.4 核磁数据处理 | 第49页 |
| 3.6 谷氨酰胺酶抑制剂对PC-9/IR耐药细胞的影响 | 第49-50页 |
| 3.6.1 谷氨酰胺对PC-9/IR耐药细胞的影响 | 第49-50页 |
| 3.6.2 Western Blot检测PC-9/IR耐药细胞中谷氨酰胺相关蛋白表达 | 第50页 |
| 3.6.3 Compound 968与埃克替尼联用对PC-9/IR耐药细胞的影响 | 第50页 |
| 3.7 统计学处理 | 第50-51页 |
| 4 实验结果 | 第51-79页 |
| 4.1 A549,H1975和PC-9细胞EGFR突变状态的检测 | 第51-52页 |
| 4.1.1 EGFR18、19、20、21外显子PCR扩增 | 第51页 |
| 4.1.2 直接测序法-检测EGFR基因突变的结果 | 第51-52页 |
| 4.2 耐药细胞株的建立 | 第52-56页 |
| 4.2.1 埃克替尼对不同EGFR突变状态细胞生长的影响 | 第52-53页 |
| 4.2.2 埃克替尼对PC-9细胞克隆能力形成的影响 | 第53-54页 |
| 4.2.3 埃克替尼对PC-9细胞凋亡的影响 | 第54-56页 |
| 4.3 耐药细胞株的鉴定 | 第56-61页 |
| 4.3.1 MTT法测耐药细胞的耐药性 | 第56-57页 |
| 4.3.2 耐药细胞株稳定性的测定 | 第57页 |
| 4.3.3 耐药细胞的形态学观察 | 第57-58页 |
| 4.3.4 EGFR T790M突变检测 | 第58-59页 |
| 4.3.5c-Met过表达的检测 | 第59-60页 |
| 4.3.6 PC-9/IR耐药株小鼠移植瘤模型的建立及其体外、内增殖能力的检测 | 第60-61页 |
| 4.4 NMR检测亲本细胞和耐药细胞代谢物差异 | 第61-74页 |
| 4.4.1 代谢轮廓归属谱图 | 第61-62页 |
| 4.4.2 代谢物种类与浓度 | 第62-65页 |
| 4.4.3 多变量统计学分析 | 第65-74页 |
| 4.5 PC-9/IR耐药细胞生长对谷氨酰胺存在依赖性 | 第74-79页 |
| 4.5.1 谷氨酰胺酶抑制剂抑制PC-9/IR耐药细胞的增殖 | 第74-76页 |
| 4.5.2 C-MYC在PC-9/IR耐药细胞中的表达情况 | 第76-79页 |
| 5 讨论 | 第79-83页 |
| 6 结论 | 第83-85页 |
| 参考文献 | 第85-91页 |
| 附录 A | 第91-93页 |
| 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第93-97页 |
| 学位论文数据集 | 第97页 |
